ပိုးသတ်ဆေး N၊N-diethyl-m-toluamide (DEET) သည် AChE (acetylcholinesterase) ကို တားစီးနိုင်သည်ဟု အစီရင်ခံထားပြီး အလွန်အကျွံ သွေးကြောချဲ့ခြင်းကြောင့် ကင်ဆာဖြစ်စေနိုင်သော ဂုဏ်သတ္တိများရှိသည်။ ဤစာတမ်းတွင်၊ DEET သည် အထူးသဖြင့် angiogenesis ကိုမြှင့်တင်ပေးသည့် endothelial ဆဲလ်များကိုလှုံ့ဆော်ပေးသည်၊ ထို့ကြောင့်အကျိတ်ကြီးထွားမှုကိုတိုးစေသည်။ DEET သည် ကြီးထွားခြင်း၊ ရွှေ့ပြောင်းခြင်းနှင့် ကပ်တွယ်ခြင်း အပါအဝင် angiogenesis သို့ ဦးတည်စေသည့် ဆယ်လူလာဖြစ်စဉ်များကို အသက်သွင်းသည်။ ၎င်းသည် endothelial ဆဲလ်များရှိ NO ထုတ်လုပ်မှုနှင့် VEGF ဖော်ပြမှု တိုးလာခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေသည်။ M3 ကို အသံတိတ်ခြင်း သို့မဟုတ် ဆေးဝါးဗေဒ M3 inhibitors များကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် DEET-induced angiogenesis သည် M3-sensitive ဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုခြင်းဖြင့် ဤသက်ရောက်မှုအားလုံးကို ဖျက်သိမ်းလိုက်ပါသည်။ endothelial နှင့် HEK ဆဲလ်များတွင် ကယ်လ်စီယမ်အချက်ပြခြင်း ပါ၀င်သော စမ်းသပ်မှုများတွင် M3 receptors များအပြင် ချိတ်တွယ်ခြင်းနှင့် အထိုင်ချခြင်းလေ့လာမှုများက DEET သည် M3 receptors များ၏ allosteric modulator အဖြစ်လုပ်ဆောင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ထို့အပြင် DEET သည် AChE ကို ဟန့်တားပေးသည်၊ ထို့ကြောင့် acetylcholine ၏ ဇီဝရရှိနိုင်မှုနှင့် ၎င်း၏ M3 receptors များနှင့် ချိတ်ဆက်မှုကို တိုးမြင့်စေပြီး allosteric စည်းမျဉ်းအားဖြင့် proangiogenic သက်ရောက်မှုများကို မြှင့်တင်ပေးသည်။
Primary EC များကို ဆွဇ်ကြွက်များ၏ aorta နှင့် သီးခြားခွဲထားသည်။ ထုတ်ယူသည့်နည်းလမ်းကို Kobayashi protocol 26 မှ ဆီလျော်အောင်ပြုလုပ်ထားသည်။ Murine EC များကို စတုတ္ထအကြိမ်အထိ FBS 5% ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည့် EBM-2 ကြားခံတွင် မွေးမြူထားပါသည်။
HUVEC၊ U87MG သို့မဟုတ် BF16F10 ပြန့်ပွားမှုအပေါ် DEET ၏ ပြင်းအား နှစ်ခု၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ အတိုချုပ်အားဖြင့် ရေတွင်းတစ်ခုလျှင် ဆဲလ် ၅.၁၀၃ ကို ၉၆ ရေတွင်းပန်းကန်ပြားတစ်ခုတွင် မျိုးစေ့ချကာ တစ်ညလုံး ပူးတွဲခွင့်ပြုပြီးနောက် DEET ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ ကုသခဲ့သည်။ ကြီးထွားမှုအလတ်စားကို ဖယ်ရှားပြီးနောက်၊ မိုက်ခရိုပလတ်တစ်ခုစီ၏ ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် ဆိုးဆေးထည့်ထားသောဖြေရှင်းချက်ကို ထည့်ပြီး 37 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ဆဲလ်များကို မိနစ် 30 ကြာ သားဖောက်ပါ။ 485 nm excitation filters နှင့် 530 nm emission filters များ တပ်ဆင်ထားသော Mithras LB940 multimode microplate reader (Berthold Technologies၊ Bad Wildbad၊ Germany) မှ ရောင်ရမ်းမှုအဆင့်များကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
HUVEC ကို ရေတွင်းတစ်ခုလျှင် ဆဲလ် ၁၀၄ ဆဲလ်သိပ်သည်းဆဖြင့် ရေတွင်း ၉၆ တွင်းတွင် မျိုးစေ့ချထားသည်။ ဆဲလ်များကို DEET ဖြင့် 24 နာရီကြာ ကုသခဲ့သည်။ ဆဲလ်ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို colorimetric MTT assay (Sigma-Aldrich, M5655) အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ လှိုင်းအလျား 570 nm ဖြင့် multimode microplate reader (Mithras LB940) တွင် Optical သိပ်သည်းဆတန်ဖိုးများကို ရရှိခဲ့သည်။
DEET ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို in vitro angiogenesis assays သုံးပြီးလေ့လာခဲ့သည်။ 10-8 M သို့မဟုတ် 10-5 M DEET ဖြင့် ကုသခြင်းသည် HUVECs များတွင် သွေးကြောမျှင်များ၏ အရှည်ကို တိုးပွားစေသည် (ပုံ။ 1a၊ b၊ အဖြူတုံးများ)။ ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက 10-14 မှ 10-5 M အထိ DEET ပြင်းအား ဖြင့် ကုသမှုသည် သွေးကြောမျှင် အရှည်သည် 10-8 M DEET တွင် ကုန်းပြင်မြင့်သို့ ရောက်ရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ S2)။ 10-8 M နှင့် 10-5 M အကြားအာရုံစူးစိုက်မှုအကွာအဝေးတွင် DEET ဖြင့်ကုသသော HUVECs ၏ in vitro proangiogenic အကျိုးသက်ရောက်မှုတွင် သိသာထင်ရှားသောကွာခြားမှုမတွေ့ရှိရပါ။
neovascularization တွင် DEET ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကိုဆုံးဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် vivo neovascularization လေ့လာမှုများတွင်လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ 14 ရက်အကြာတွင်၊ 10-8 M သို့မဟုတ် 10-5 M DEET ဖြင့်ကြိုတင်ထုတ်လုပ်ထားသော endothelial ဆဲလ်များဖြင့်ထိုးသွင်းထားသောကြွက်များသည် ဟေမိုဂလိုဘင်ပါဝင်မှုသိသိသာသာတိုးလာသည် (ပုံ။ 1c၊ အဖြူရောင်ဘားများ) ကိုပြသခဲ့သည်။
ထို့အပြင်၊ DEET ဖြစ်ပေါ်စေသော neovascularization ကို U87MG xenograft-bearing ကြွက်များတွင် DEET ဖြင့် နေ့စဉ် (ip) ထိုးသွင်းသည့် ကြွက်များတွင် ပလာစမာပါဝင်မှုနှုန်း 10-5 M ကို လှုံ့ဆော်ပေးသည့် လူသိများသော ဆေးပမာဏဖြင့် လေ့လာခဲ့သည်။ 23. တွင် တွေ့ရှိနိုင်သောအကျိတ်များ (ဆိုလိုသည်မှာ အကျိတ်များ > 100 mm3) သည် U87MG ဆဲလ်များကို ကြွက်များထဲသို့ ထိုးသွင်းပြီးနောက် 14 ရက်အကြာတွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ရက် 28 တွင်၊ ထိန်းချုပ်ကြွက်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက DEET ကုသသောကြွက်များတွင် အကျိတ်ကြီးထွားမှု သိသိသာသာ တိုးလာပါသည်။ ထို့အပြင် CD31 အကျိတ်များကို စွန်းထင်းစေသော DEET သည် သွေးကြောမျှင်ဧရိယာကို သိသိသာသာတိုးလာစေသော်လည်း microvessel သိပ်သည်းဆမဟုတ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ (ပုံ။ 1e–g)။
DETA ကြီးထွားလာမှုတွင် muscarinic receptors များ၏အခန်းကဏ္ဍကိုဆုံးဖြတ်ရန် pFHHSiD (10-7 M၊ ရွေးချယ်ထားသော M3 receptor antagonist) ၏ရှေ့မှောက်တွင် 10-8 M သို့မဟုတ် 10-5 M DETA ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ HUVEC ကုသမှု။ pFHHSiD သည် DETA ၏ ပြင်းအားအားလုံး (ဇယား 1) တွင် အပြည့်အဝ ပိတ်ဆို့ထားသည်။
ဤအခြေအနေများအောက်တွင် DEET သည် HUVEC ဆဲလ်များတွင် သွေးကြောမျှင်အရှည်ကို တိုးစေခြင်း ရှိ၊ မရှိကိုလည်း စစ်ဆေးခဲ့သည်။ အလားတူပင်၊ pFHHSiD သည် DEET-သွေးဆောင်ထားသော သွေးကြောမျှင်များ၏ အရှည်ကို သိသိသာသာ တားဆီးခဲ့သည် (ပုံ။ 1a၊ b၊ မီးခိုးရောင်ဘားများ)။ ထို့အပြင် အလားတူ စမ်းသပ်မှုများကို M3 siRNA ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ်မှု siRNA သည် သွေးကြောမျှင်များဖွဲ့စည်းခြင်းကို မြှင့်တင်ရာတွင် ထိရောက်မှု မရှိသော်လည်း M3 muscarinic receptor ၏ အသံတိတ်ခြင်းသည် သွေးကြောမျှင်များ၏အရှည်ကို တိုးမြှင့်ရန် DEET စွမ်းရည်ကို ဖျက်သိမ်းလိုက်သည် (ပုံ။ 1a၊ b၊ အနက်ရောင်ဘားများ)။
ထို့အပြင်၊ 10-8 M သို့မဟုတ် 10-5 M DEET ဗီထရိုရှိ သွေးကြောချဲ့ခြင်း နှင့် vivo ရှိ သွေးကြောချဲ့ခြင်း နှစ်ခုလုံးကို pFHHSiD (ပုံ. 1c၊ d၊ စက်ဝိုင်း) ဖြင့် လုံးဝပိတ်ဆို့ထားပါသည်။ ဤရလဒ်များသည် DEET သည် ရွေးချယ်ထားသော M3 receptor antagonists သို့မဟုတ် M3 siRNA အတွက် အထိခိုက်မခံသောလမ်းကြောင်းမှတဆင့် angiogenesis ကိုမြှင့်တင်ပေးကြောင်းဖော်ပြသည်။
AChE သည် DEET ၏ မော်လီကျူးပစ်မှတ်ဖြစ်သည်။ AChE inhibitors များအဖြစ် လုပ်ဆောင်သည့် ဒိုးပတ်ဇီးလ်ကဲ့သို့သော ဆေးဝါးများသည် EC angiogenesis in vitro နှင့် mouse hindlimb ischemia ပုံစံများ14 တွင် လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်သည်။ HUVEC ရှိ AChE အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက်အပေါ် DEET ပြင်းအား နှစ်ခု၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ်မှုအခြေအနေများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက DEET ၏ အနိမ့် (10-8 M) နှင့် မြင့်မားသော (10-5 M) ပြင်းအားသည် endothelial AChE လုပ်ဆောင်ချက် လျော့နည်းသွားသည် (ပုံ။ 2)။
DEET ၏ပြင်းအားနှစ်ခုလုံး (10-8 M နှင့် 10-5 M) သည် HUVEC တွင် acetylcholinesterase လုပ်ဆောင်ချက်ကို လျော့ကျစေသည်။ BW284c51 (10-5 M) ကို acetylcholinesterase inhibitors များအတွက် ထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ရလဒ်များကို ကားဖြင့်ကုသသောဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက DEET ပြင်းအားနှစ်ခုဖြင့် ကုသထားသော HUVEC တွင် AChE လုပ်ဆောင်ချက်၏ ရာခိုင်နှုန်းအဖြစ် ဖော်ပြသည်။ အမှီအခိုကင်းသော စမ်းသပ်မှုခြောက်ခု၏ ဆိုလိုရင်း ± SEM သည် တန်ဖိုးများကို ဖော်ပြသည်။ * p < 0.05 ထိန်းချုပ်မှု (Kruskal-Wallis နှင့် Dunn မျိုးစုံနှိုင်းယှဉ်စမ်းသပ်မှု)
နိုက်ထရစ်အောက်ဆိုဒ် (NO) သည် angiogenic ဖြစ်စဉ် 33 တွင်ပါ၀င်သောကြောင့် DEET လှုံ့ဆော်သော HUVECs များတွင် ထုတ်လုပ်မှုမရှိခြင်းကို လေ့လာခဲ့သည်။ DEET ဖြင့် ကုသထားသော endothelial NO ထုတ်လုပ်မှုသည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက တိုးလာသော်လည်း 10-8 M (ပုံ. 3c) ပမာဏတွင်သာ အရေးပါလာပါသည်။ DEET ဖြစ်ပေါ်စေသော ထုတ်လုပ်မှုမရှိခြင်းကို ထိန်းချုပ်သည့် မော်လီကျူးပြောင်းလဲမှုများကို ဆုံးဖြတ်ရန်၊ eNOS ဖော်ပြမှုနှင့် အသက်သွင်းမှုကို အနောက်တိုင်းမှ ပိတ်ဆို့ခြင်းများဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ DEET ကုသမှုသည် eNOS ဖော်ပြမှုကို မပြောင်းလဲသော်လည်း၊ ၎င်းသည် ၎င်း၏ eNOS phosphorylation (ပုံ 3d) တွင် မကုသရသေးသောဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ၎င်း၏အသက်ဝင်သည့်နေရာ (Ser-1177) တွင် eNOS phosphorylation ကို သိသိသာသာတိုးမြင့်စေသည်။ ထို့အပြင်၊ activation site နှင့် inhibitory site ရှိ phosphorylated eNOS ၏အချိုးကို phosphorylated eNOS ပမာဏကို အင်ဇိုင်းစုစုပေါင်းပမာဏသို့ ပုံမှန်ဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ပြီးနောက် တွက်ချက်ခဲ့ပါသည်။ မကုသရသေးသောဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက DEET ၏အာရုံစူးစိုက်မှုတစ်ခုစီနှင့် ကုသထားသော HUVEC များတွင် ဤအချိုးသည် သိသိသာသာတိုးလာသည်။
နောက်ဆုံးတွင်၊ အဓိက proangiogenic အကြောင်းရင်းများထဲမှတစ်ခုဖြစ်သော VEGF ၏ဖော်ပြမှုကို အနောက်တိုင်းမှ ပိတ်ဆို့ခြင်းများဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ pFHHSiD သည် ဤအသုံးအနှုန်းကို လုံးလုံးလျားလျား ပိတ်ဆို့ထားသော်လည်း DEET သည် VEGF ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုကို သိသာစွာ တိုးပွားစေသည်။
DEET ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုများသည် M3 receptors များ၏ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာပိတ်ဆို့ခြင်းနှင့်ထိန်းချုပ်မှုလျှော့ချခြင်းနှစ်ခုလုံးအပေါ်အထိခိုက်မခံသောကြောင့် DEET သည်ကယ်လစီယမ်အချက်ပြခြင်းကိုတိုးမြှင့်နိုင်သည်ဟူသောယူဆချက်ကိုကျွန်ုပ်တို့စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ အံ့အားသင့်စရာမှာ၊ DEET သည် HUVEC တွင် cytoplasmic ကယ်လ်စီယမ်ကို တိုးမလာအောင် ပျက်ကွက်ခဲ့သည် (ဒေတာမပြပါ) နှင့် HEK/M3 (ပုံ။ 4a၊ b) နှစ်မျိုးလုံးတွင် အသုံးပြုထားသော ပြင်းအားဖြစ်သည်။
စာတိုက်အချိန်- ဒီဇင်ဘာ-၃၀-၂၀၂၄