သန်ချဆေး N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) သည် AChE (acetylcholinesterase) ကို ဟန့်တားပေးသည်ဟု သတင်းပို့ထားပြီး သွေးကြောများ အလွန်အကျွံ ဖောင်းပွလာခြင်းကြောင့် ကင်ဆာဖြစ်စေနိုင်သော ဂုဏ်သတ္တိများ ရှိကြောင်း သတင်းပို့ထားပါသည်။ ဤစာတမ်းတွင် DEET သည် angiogenesis ကို မြှင့်တင်ပေးသည့် endothelial ဆဲလ်များကို အထူးလှုံ့ဆော်ပေးပြီး အကျိတ်ကြီးထွားမှုကို တိုးမြင့်စေကြောင်း ပြသထားပါသည်။ DEET သည် ပွားများခြင်း၊ ရွှေ့ပြောင်းခြင်းနှင့် ကပ်ငြိခြင်း အပါအဝင် angiogenesis ကို ဦးတည်စေသည့် ဆဲလ်လုပ်ငန်းစဉ်များကို အသက်ဝင်စေပါသည်။ ၎င်းသည် endothelial ဆဲလ်များတွင် NO ထုတ်လုပ်မှုနှင့် VEGF ဖော်ပြမှု တိုးလာခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေပါသည်။ M3 ကို တိတ်ဆိတ်စေခြင်း သို့မဟုတ် ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာ M3 inhibitors များကို အသုံးပြုခြင်းသည် ဤအကျိုးသက်ရောက်မှုအားလုံးကို ဖျက်သိမ်းလိုက်ပြီး DEET ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော angiogenesis သည် M3-sensitive ဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ endothelial နှင့် M3 receptors များကို အလွန်အကျွံဖော်ပြသော HEK ဆဲလ်များတွင် ကယ်လ်စီယမ် အချက်ပြမှုပါဝင်သည့် စမ်းသပ်ချက်များအပြင် binding နှင့် docking လေ့လာမှုများအရ DEET သည် M3 receptors များ၏ allosteric modulator အဖြစ် လုပ်ဆောင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေပါသည်။ ထို့အပြင် DEET သည် AChE ကို ဟန့်တားပေးပြီး acetylcholine ၏ bioavailability နှင့် M3 receptors များနှင့် ၎င်း၏ ချည်နှောင်မှုကို တိုးမြင့်စေပြီး allosteric regulation မှတစ်ဆင့် proangiogenic အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို မြှင့်တင်ပေးပါသည်။
မူလ EC များကို ဆွစ်ဇာလန်ကြွက်များ၏ aorta မှ ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ ထုတ်ယူခြင်းနည်းလမ်းကို Kobayashi protocol 26 မှ ပြုပြင်ထားသည်။ Murine EC များကို 5% အပူပေးပြီး အသက်မဝင်စေသော FBS ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသော EBM-2 medium တွင် စတုတ္ထအကြိမ်အထိ မွေးမြူခဲ့သည်။
HUVEC၊ U87MG သို့မဟုတ် BF16F10 ပွားများမှုအပေါ် DEET ပါဝင်မှု နှစ်ခု၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် well တစ်ခုလျှင် ဆဲလ် ၅.၁၀၃ လုံးကို well ၉၆ well ပြားတစ်ခုတွင် စိုက်ထည့်ပြီး တစ်ညလုံးကပ်ထားကာ DEET ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ ကုသပေးခဲ့သည်။ growth medium ကို ဖယ်ရှားပြီးနောက်၊ microplate ၏ well တစ်ခုစီတွင် dye binding solution ကိုထည့်ပြီး ဆဲလ်များကို ၃၇°C တွင် ၃၀ မိနစ်ကြာ incubate လုပ်ပါ။ fluorescence အဆင့်များကို 485 nm excitation filter များနှင့် 530 nm emission filter များတပ်ဆင်ထားသော Mithras LB940 multimode microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
HUVEC ကို well 96-well plates များတွင် well တစ်ခုလျှင် cell 104 ခု သိပ်သည်းဆဖြင့် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို DEET ဖြင့် ၂၄ နာရီကြာ ကုသခဲ့သည်။ colorimetric MTT assay (Sigma-Aldrich, M5655) ကို အသုံးပြု၍ ဆဲလ် အသက်ရှင်နိုင်မှုကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ optical density တန်ဖိုးများကို multimode microplate reader (Mithras LB940) တွင် 570 nm wavelength တွင် ရရှိခဲ့သည်။
DEET ၏ အာနိသင်များကို in vitro angiogenesis assays များကို အသုံးပြု၍ လေ့လာခဲ့သည်။ 10-8 M သို့မဟုတ် 10-5 M DEET ဖြင့် ကုသခြင်းသည် HUVECs တွင် capillary length ဖွဲ့စည်းမှုကို တိုးစေသည် (ပုံ 1a၊ b၊ အဖြူရောင်ဘားများ)။ ထိန်းချုပ်အဖွဲ့နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက 10-14 မှ 10-5 M အထိ DEET ပါဝင်မှုများဖြင့် ကုသခြင်းသည် capillary length သည် 10-8 M DEET တွင် တည်ငြိမ်မှုသို့ ရောက်ရှိကြောင်း ပြသသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ S2)။ 10-8 M နှင့် 10-5 M ပါဝင်မှုအပိုင်းအခြားတွင် DEET ဖြင့် ကုသထားသော HUVECs များ၏ in vitro proangiogenic အာနိသင်တွင် သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက် မတွေ့ရှိရပါ။
DEET သည် သွေးကြောအသစ်ဖြစ်ပေါ်ခြင်းအပေါ် အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် in vivo neovascularization လေ့လာမှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ ၁၄ ရက်အကြာတွင် 10-8 M သို့မဟုတ် 10-5 M DEET ဖြင့် ကြိုတင်ပြုစုပျိုးထောင်ထားသော endothelial ဆဲလ်များကို ထိုးသွင်းထားသော ကြွက်များတွင် ဟေမိုဂလိုဘင်ပါဝင်မှု သိသိသာသာ မြင့်တက်လာသည်ကို တွေ့ရှိခဲ့ရပါသည် (ပုံ ၁ဂ၊ အဖြူရောင်ဘားများ)။
ထို့အပြင်၊ DEET ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော သွေးကြောအသစ်ဖွဲ့စည်းမှုကို U87MG xenograft သယ်ဆောင်ထားသော ကြွက်များတွင် လေ့လာခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် ထိတွေ့ထားသော လူသားများတွင် ပုံမှန်ဖြစ်သည်။ ၂၃။ ကြွက်များထဲသို့ U87MG ဆဲလ်များထိုးသွင်းပြီး ၁၄ ရက်အကြာတွင် တွေ့ရှိနိုင်သော အကျိတ်များ (ဆိုလိုသည်မှာ အကျိတ် ၁၀၀ mm3 ထက်များသော အကျိတ်များ) ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ၂၈ ရက်မြောက်နေ့တွင် ထိန်းချုပ်ကြွက်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက DEET ကုသထားသော ကြွက်များတွင် အကျိတ်ကြီးထွားမှု သိသိသာသာ မြင့်တက်လာသည် (ပုံ ၁d၊ လေးထောင့်ကွက်များ)။ ထို့အပြင်၊ အကျိတ်များ၏ CD31 ဆိုးဆေးက DEET သည် ဆံချည်မျှင်သွေးကြောဧရိယာကို သိသိသာသာ တိုးလာစေသော်လည်း မိုက်ခရိုသွေးကြောသိပ်သည်းဆကို မတိုးစေကြောင်း ပြသသည်။ (ပုံ ၁e–g)။
DETA ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်သော မျိုးပွားမှုတွင် muscarinic receptors များ၏ အခန်းကဏ္ဍကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် pFHHSiD (10-7 M၊ ရွေးချယ်ထားသော M3 receptor antagonist) ရှိနေချိန်တွင် 10-8 M သို့မဟုတ် 10-5 M DETA ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ HUVEC ကုသမှု။ pFHHSiD သည် ပြင်းအားအားလုံးတွင် DETA ၏ မျိုးပွားနိုင်စွမ်းကို လုံးဝပိတ်ဆို့ထားသည် (ဇယား ၁)။
ဤအခြေအနေများအောက်တွင်၊ DEET သည် HUVEC ဆဲလ်များတွင် ဆံချည်မျှင်သွေးကြောအရှည်ကို တိုးစေမည်လားဆိုသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ အလားတူပင်၊ pFHHSiD သည် DEET ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော ဆံချည်မျှင်သွေးကြောအရှည်ကို သိသိသာသာ ကာကွယ်ပေးသည် (ပုံ ၁က၊ ခ၊ မီးခိုးရောင်ဘားများ)။ ထို့အပြင်၊ M3 siRNA ဖြင့် အလားတူစမ်းသပ်မှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ် siRNA သည် ဆံချည်မျှင်သွေးကြောဖွဲ့စည်းမှုကို မြှင့်တင်ရာတွင် ထိရောက်မှုမရှိသော်လည်း၊ M3 muscarinic receptor ကို တိတ်ဆိတ်စေခြင်းသည် DEET ၏ ဆံချည်မျှင်သွေးကြောအရှည်ကို တိုးစေနိုင်စွမ်းကို ပျက်ပြယ်စေသည် (ပုံ ၁က၊ ခ၊ အနက်ရောင်ဘားများ)။
ထို့အပြင်၊ 10-8 M သို့မဟုတ် 10-5 M DEET ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်သော in vitro vascularization နှင့် in vivo neovascularization နှစ်မျိုးလုံးကို pFHHSiD မှ လုံးဝပိတ်ဆို့ထားသည် (ပုံ 1c၊ d၊ စက်ဝိုင်း)။ ဤရလဒ်များသည် DEET သည် ရွေးချယ်ထားသော M3 receptor antagonists သို့မဟုတ် M3 siRNA ကို အာရုံခံနိုင်သော လမ်းကြောင်းမှတစ်ဆင့် angiogenesis ကို မြှင့်တင်ပေးသည်ဟု ညွှန်ပြသည်။
AChE သည် DEET ၏ မော်လီကျူးပစ်မှတ်ဖြစ်သည်။ AChE inhibitors အဖြစ်လုပ်ဆောင်သော donepezil ကဲ့သို့သောဆေးဝါးများသည် in vitro နှင့် mouse hindlimb ischemia models14 တွင် EC angiogenesis ကိုလှုံ့ဆော်ပေးနိုင်သည်။ HUVEC တွင် AChE enzyme လှုပ်ရှားမှုအပေါ် DEET ပါဝင်မှုနှစ်မျိုး၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ DEET ပါဝင်မှုနည်းသော (10-8 M) နှင့် များသော (10-5 M) သည် ထိန်းချုပ်အခြေအနေများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက endothelial AChE လှုပ်ရှားမှုကို လျော့နည်းစေသည် (ပုံ ၂)။
DEET ပါဝင်မှု နှစ်မျိုးလုံး (10-8 M နှင့် 10-5 M) သည် HUVEC တွင် acetylcholinesterase လုပ်ဆောင်ချက်ကို လျော့နည်းစေပါသည်။ BW284c51 (10-5 M) ကို acetylcholinesterase inhibitors အတွက် ထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ရလဒ်များကို ယာဉ်ဖြင့် ကုသထားသော ဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက DEET ပါဝင်မှု နှစ်မျိုးဖြင့် ကုသထားသော HUVEC တွင် AChE လုပ်ဆောင်ချက်၏ ရာခိုင်နှုန်းအဖြစ် ဖော်ပြထားပါသည်။ တန်ဖိုးများကို လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်ချက် ခြောက်ခု၏ ပျမ်းမျှ ± SEM အဖြစ် ဖော်ပြထားပါသည်။ ထိန်းချုပ်မှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက *p < 0.05 (Kruskal-Wallis နှင့် Dunn မျိုးစုံ နှိုင်းယှဉ်မှု စမ်းသပ်မှု)။
နိုက်ထရစ်အောက်ဆိုဒ် (NO) သည် angiogenic လုပ်ငန်းစဉ် 33 တွင်ပါဝင်သောကြောင့် DEET လှုံ့ဆော်ပေးသော HUVECs များတွင် NO ထုတ်လုပ်မှုကို လေ့လာခဲ့သည်။ DEET ကုသထားသော endothelial NO ထုတ်လုပ်မှုသည် ထိန်းချုပ်ဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက တိုးလာသော်လည်း 10-8 M ပမာဏတွင်သာ သိသာထင်ရှားမှုရောက်ရှိခဲ့သည် (ပုံ 3c)။ DEET ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော NO ထုတ်လုပ်မှုကို ထိန်းချုပ်သော မော်လီကျူးပြောင်းလဲမှုများကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် eNOS ဖော်ပြမှုနှင့် အသက်ဝင်မှုကို Western blotting ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ DEET ကုသမှုသည် eNOS ဖော်ပြမှုကို မပြောင်းလဲစေသော်လည်း၊ eNOS phosphorylation ရှိ ကုသမှုမခံယူရသေးသောဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ၎င်း၏ inhibitory site (Thr-495) ကို လျော့နည်းစေပြီး ၎င်း၏ activating site (Ser-1177) တွင် eNOS phosphorylation ကို သိသိသာသာတိုးစေသည် (ပုံ 3d)။ ထို့အပြင်၊ activation site နှင့် inhibitory site ရှိ phosphorylated eNOS အချိုးကို အင်ဇိုင်းစုစုပေါင်းပမာဏနှင့် phosphorylated eNOS ပမာဏကို ပုံမှန်ဖြစ်စေပြီးနောက် တွက်ချက်ခဲ့သည်။ ကုသမှုမခံယူရသေးသောဆဲလ်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက DEET ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုတစ်ခုစီဖြင့် ကုသထားသော HUVECs တွင် ဤအချိုးသည် သိသိသာသာတိုးလာသည် (ပုံ 3d)။
နောက်ဆုံးအနေနဲ့ သွေးကြောဖွံ့ဖြိုးမှုကို အားပေးတဲ့ အဓိကအချက်တွေထဲက တစ်ခုဖြစ်တဲ့ VEGF ရဲ့ ဖော်ပြမှုကို Western blotting နည်းနဲ့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါတယ်။ DEET က VEGF ဖော်ပြမှုကို သိသိသာသာ မြင့်တက်စေပေမယ့် pFHHSiD ကတော့ ဒီဖော်ပြမှုကို လုံးဝပိတ်ဆို့ထားပါတယ်။
DEET ၏ အာနိသင်များသည် M3 receptors များ၏ ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာ ပိတ်ဆို့ခြင်းနှင့် လျော့နည်းစေခြင်း နှစ်မျိုးလုံးအပေါ် အာရုံခံနိုင်စွမ်းမရှိသောကြောင့်၊ DEET သည် ကယ်လ်စီယမ် အချက်ပြမှုကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်သည်ဟူသော ယူဆချက်ကို ကျွန်ုပ်တို့ စမ်းသပ်ခဲ့ပါသည်။ အံ့သြစရာကောင်းသည်မှာ အသုံးပြုထားသော ပြင်းအားနှစ်မျိုးလုံးအတွက် HUVEC (ဒေတာမပြထားပါ) နှင့် HEK/M3 (ပုံ ၄က၊ ခ) တွင် ဆိုက်တိုပလာစမစ် ကယ်လ်စီယမ်ကို မြှင့်တင်ရန် DEET မအောင်မြင်ခဲ့ပါ။
ပို့စ်တင်ချိန်: ၂၀၂၄ ခုနှစ်၊ ဒီဇင်ဘာလ ၃၀ ရက်