အရေအတွက်ဆိုင်ရာ ဂျစ်ဘာရယ်လင် ဇီဝအာရုံခံကိရိယာသည် အပင်၏ အဖျားပိုင်း အမြီးပိုင်းရှိ အတွင်းပိုင်း သတ်မှတ်ချက်တွင် ဂျစ်ဘာရယ်လင်များ၏ အခန်းကဏ္ဍကို ဖော်ပြသည်

အပင်ထိပ်ပိုင်းအမြှေးပါး (SAM) ကြီးထွားမှုသည် ပင်စည်ဗိသုကာအတွက် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။ အပင်ဟော်မုန်းများဂျစ်ဘယ်ရယ်လင်များ(GAs) များသည် အပင်ကြီးထွားမှုကို ညှိနှိုင်းရာတွင် အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သော်လည်း SAM တွင် ၎င်းတို့၏ အခန်းကဏ္ဍကို နားမလည်နိုင်သေးပါ။ ဤတွင်၊ GA transcriptional response တွင် ၎င်း၏ မရှိမဖြစ် ထိန်းညှိပေးသော လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဖိနှိပ်ရန် DELLA ပရိုတိန်းကို အင်ဂျင်နီယာပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် GA အချက်ပြမှု၏ ratiometric biosensor တစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ တီထွင်ခဲ့ပြီး GA မှတ်မိသည့်အခါ ၎င်း၏ ပျက်စီးမှုကို ထိန်းသိမ်းထားခဲ့သည်။ ဤပျက်စီးမှုကို အခြေခံသော biosensor သည် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကာလအတွင်း GA အဆင့်များနှင့် ဆဲလ်အာရုံခံမှုတို့တွင် ပြောင်းလဲမှုများကို တိကျစွာ မှတ်တမ်းတင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြပါသည်။ SAM တွင် GA အချက်ပြမှု လုပ်ဆောင်ချက်ကို မြေပုံဆွဲရန် ဤ biosensor ကို ကျွန်ုပ်တို့ အသုံးပြုခဲ့သည်။ မြင့်မားသော GA အချက်ပြမှုများသည် internode ဆဲလ်များ၏ ရှေ့ပြေးနိမိတ်များဖြစ်သော အင်္ဂါ primordia အကြားတွင် တည်ရှိသော ဆဲလ်များတွင် အဓိကအားဖြင့် ရှိနေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ပြသပါသည်။ gain- နှင့် loss-of-function ချဉ်းကပ်မှုများကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် GA သည် ဆဲလ်ကွဲပြားမှု မျက်နှာပြင်၏ orientation ကို ထိန်းညှိပေးပြီး internodes များ၏ canonical cellular organization ကို တည်ထောင်ကာ SAM တွင် internode specification ကို မြှင့်တင်ပေးကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ထပ်မံသရုပ်ပြပါသည်။
အညွန့်ထိပ်တွင်တည်ရှိသော အညွန့်ထိပ် meristem (SAM) တွင် အပင်၏သက်တမ်းတစ်လျှောက်လုံး modular နှင့် iterative ပုံစံဖြင့် lateral organs များနှင့် stem nodes များကိုထုတ်ပေးသည့် stem cells များ၏ niche တစ်ခုပါရှိသည်။ ဤထပ်ခါတလဲလဲလုပ်ဆောင်သော units များ သို့မဟုတ် plant nodes တစ်ခုစီတွင် nodes များရှိ internodes များနှင့် lateral organs များနှင့် leaf axils များရှိ axillary meristems များပါဝင်သည်။ အပင် nodes များ၏ ကြီးထွားမှုနှင့်စီစဉ်မှုသည် ဖွံ့ဖြိုးမှုကာလအတွင်း ပြောင်းလဲသည်။ Arabidopsis တွင်၊ internodal ကြီးထွားမှုသည် vegetative stage တွင် ဖိနှိပ်ခံရပြီး axillary meristems များသည် rosette အရွက်များ၏ axils တွင် အိပ်မပျော်ဘဲရှိနေသည်။ ပန်းပွင့်အဆင့်သို့ကူးပြောင်းချိန်တွင် SAM သည် inflorescence meristem ဖြစ်လာပြီး ရှည်လျားသော internodes များနှင့် axillary buds များ၊ cauline အရွက်များ၏ axils တွင် branchlets များနှင့် နောက်ပိုင်းတွင် အရွက်မဲ့ပန်းများဖြစ်ပေါ်စေသည်2။ အရွက်များ၊ ပန်းများနှင့် အကိုင်းအခက်များစတင်ခြင်းကို ထိန်းချုပ်သည့် ယန္တရားများကို နားလည်ရာတွင် သိသာထင်ရှားသောတိုးတက်မှုများရရှိခဲ့သော်လည်း internodes များ မည်သို့ပေါ်ပေါက်လာသည်ကို အနည်းငယ်သာသိရှိရသည်။
GA များ၏ spatiotemporal ဖြန့်ဖြူးမှုကို နားလည်ခြင်းသည် မတူညီသောတစ်ရှူးများနှင့် မတူညီသော ဖွံ့ဖြိုးမှုအဆင့်များတွင် ဤဟော်မုန်းများ၏ လုပ်ဆောင်ချက်များကို ပိုမိုနားလည်ရန် ကူညီပေးပါလိမ့်မည်။ ၎င်း၏ကိုယ်ပိုင် promoter ၏လုပ်ဆောင်ချက်အောက်တွင် ဖော်ပြထားသော RGA-GFP fusion ၏ ယိုယွင်းပျက်စီးမှုကို မြင်ယောင်ခြင်းသည် အမြစ်များတွင် စုစုပေါင်း GA အဆင့်များကို ထိန်းညှိခြင်းဆိုင်ရာ အရေးကြီးသောအချက်အလက်များကို ပေးစွမ်းသည်15,16။ သို့သော် RGA ဖော်ပြမှုသည် တစ်ရှူးများအလိုက် ကွဲပြားသည်17 နှင့် GA18 မှ ထိန်းညှိသည်။ ထို့ကြောင့် RGA promoter ၏ ကွဲပြားသော ဖော်ပြမှုသည် RGA-GFP ဖြင့် တွေ့ရှိရသည့် fluorescence ပုံစံကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ပြီး ထို့ကြောင့် ဤနည်းလမ်းသည် ပမာဏဆိုင်ရာ မဟုတ်ပါ။ မကြာသေးမီက၊ bioactive fluorescein (Fl)-labeled GA19,20 သည် အမြစ် endocortex တွင် GA စုဆောင်းမှုနှင့် GA transport ဖြင့် ၎င်း၏ဆဲလ်အဆင့်များကို ထိန်းညှိခြင်းကို ဖော်ပြခဲ့သည်။ မကြာသေးမီက၊ GA FRET sensor nlsGPS1 သည် GA အဆင့်များသည် အမြစ်များ၊ filaments များနှင့် မှောင်မိုက်သော hypocotyls21 ရှိ ဆဲလ်ရှည်ခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့တွေ့မြင်ခဲ့ရသည့်အတိုင်း၊ GA ပါဝင်မှုသည် ရှုပ်ထွေးသော sensing လုပ်ငန်းစဉ်များပေါ်တွင် မူတည်သောကြောင့် GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းချုပ်သည့် တစ်ခုတည်းသော parameter မဟုတ်ပါ။ ဤတွင်၊ DELLA နှင့် GA အချက်ပြလမ်းကြောင်းများအကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏ နားလည်မှုအပေါ် အခြေခံ၍ GA အချက်ပြမှုအတွက် degradation-based ratiometric biosensor ၏ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုနှင့် လက္ခဏာရပ်များကို ကျွန်ုပ်တို့ အစီရင်ခံပါသည်။ ဤပမာဏဆိုင်ရာ biosensor ကို တီထွင်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် fluorescent protein နှင့် ပေါင်းစပ်ပြီး တစ်ရှူးများတွင် ubiquitously ဖော်ပြထားသော mutant GA-sensitive RGA နှင့် GA-sensitive fluorescent protein တို့ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ mutant RGA protein ပေါင်းစပ်မှုများသည် ubiquitously ဖော်ပြသောအခါ endogenous GA အချက်ပြမှုကို အနှောင့်အယှက်မဖြစ်စေကြောင်းနှင့် ဤ biosensor သည် spatiotemporal resolution မြင့်မားသော sensing apparatus မှ GA input နှင့် GA signal processing နှစ်မျိုးလုံးမှ ဖြစ်ပေါ်လာသော အချက်ပြလှုပ်ရှားမှုကို ပမာဏသတ်မှတ်နိုင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ပြသထားပါသည်။ GA အချက်ပြလှုပ်ရှားမှု၏ spatiotemporal distribution ကို မြေပုံရေးဆွဲရန်နှင့် GA သည် SAM epidermis တွင် ဆဲလ်အပြုအမူကို မည်သို့ထိန်းညှိသည်ကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန် ဤ biosensor ကို ကျွန်ုပ်တို့ အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ GA သည် organ primordia အကြားတွင်တည်ရှိသော SAM ဆဲလ်များ၏ division plane ၏ orientation ကို ထိန်းညှိပေးပြီး internode ၏ canonical cellular organization ကို သတ်မှတ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ပြသထားပါသည်။
နောက်ဆုံးအနေနဲ့ qmRGA ဟာ ကြီးထွားလာတဲ့ hypocotyls တွေကို အသုံးပြုပြီး endogenous GA အဆင့်တွေမှာ ပြောင်းလဲမှုတွေကို အစီရင်ခံနိုင်မလားလို့ ကျွန်တော်တို့ မေးမြန်းခဲ့ပါတယ်။ နိုက်ထရိတ်ဟာ GA ပေါင်းစပ်မှုကို တိုးမြှင့်ပေးပြီး DELLA34 ယိုယွင်းပျက်စီးမှုကို တိုးမြှင့်ပေးခြင်းအားဖြင့် ကြီးထွားမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးတယ်ဆိုတာကို ကျွန်တော်တို့ အရင်က ပြသခဲ့ပါတယ်။ ဒါကြောင့် နိုက်ထရိတ် ပေါများတဲ့ (10 mM NO3−) နိုက်ထရိတ် ထောက်ပံ့မှုအောက်မှာ ကြီးထွားလာတဲ့ pUBQ10::qmRGA ပျိုးပင်တွေရဲ့ hypocotyl အရှည်ဟာ နိုက်ထရိတ်ချို့တဲ့တဲ့ အခြေအနေအောက်မှာ ကြီးထွားလာတဲ့ ပျိုးပင်တွေထက် သိသိသာသာ ပိုရှည်တာကို ကျွန်တော်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ရပါတယ် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 6a)။ ကြီးထွားမှု တုံ့ပြန်မှုနဲ့အညီ 10 mM NO3− အခြေအနေအောက်မှာ ကြီးထွားလာတဲ့ ပျိုးပင်တွေရဲ့ hypocotyls တွေမှာ နိုက်ထရိတ်မရှိတဲ့နေရာမှာ ကြီးထွားလာတဲ့ ပျိုးပင်တွေထက် GA အချက်ပြမှုတွေ ပိုမိုမြင့်မားခဲ့ပါတယ် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 6b၊ c)။ ဒါကြောင့် qmRGA ဟာ GA ပါဝင်မှုမှာ endogenous ပြောင်းလဲမှုတွေကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာတဲ့ GA အချက်ပြမှုမှာ ပြောင်းလဲမှုတွေကို စောင့်ကြည့်နိုင်စေပါတယ်။
qmRGA မှ ထောက်လှမ်းရရှိသော GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်သည် အာရုံခံဒီဇိုင်းအပေါ် အခြေခံ၍ မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း GA ပါဝင်မှုနှင့် GA အာရုံခံမှုအပေါ် မူတည်ခြင်း ရှိ၊ မရှိကို နားလည်ရန်အတွက်၊ အပင်နှင့် မျိုးပွားတစ်ရှူးများတွင် GID1 receptors သုံးခု၏ ဖော်ပြမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည်။ ပျိုးပင်များတွင်၊ GID1-GUS သတင်းထောက်လိုင်းသည် GID1a နှင့် c တို့သည် cotyledons များတွင် မြင့်မားစွာ ဖော်ပြထားကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 3a–c)။ ထို့အပြင်၊ receptors သုံးခုစလုံးကို အရွက်များ၊ lateral root primordia၊ အမြစ်အဖျားများ (GID1b ၏ root cap မှလွဲ၍) နှင့် vascular system (ပုံ 3a–c) တို့တွင် ဖော်ပြခဲ့သည်။ inflorescence SAM တွင်၊ GID1b နှင့် 1c အတွက်သာ GUS အချက်ပြမှုများကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 7a–c)။ In situ hybridization သည် ဤဖော်ပြမှုပုံစံများကို အတည်ပြုပြီး GID1c သည် SAM တွင် အဆင့်နိမ့်များတွင် တစ်ပြေးညီ ဖော်ပြထားပြီး GID1b သည် SAM ၏ အပြင်ဘက်တွင် ပိုမိုမြင့်မားသော ဖော်ပြမှုကို ပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 7d–l)။ pGID1b::2xmTQ2-GID1b translational fusion သည် SAM ၏အလယ်ဗဟိုတွင် နိမ့်ကျသော သို့မဟုတ် မရှိသော ဖော်ပြချက်မှ ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါများ၏ နယ်နိမိတ်တွင် မြင့်မားသော ဖော်ပြချက်အထိ GID1b ဖော်ပြချက်၏ အဆင့်သတ်မှတ်ထားသော အပိုင်းအခြားကိုလည်း ဖော်ထုတ်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 7m)။ ထို့ကြောင့် GID1 receptors များသည် တစ်ရှူးများတစ်လျှောက်နှင့် တစ်ရှူးများအတွင်းတွင် ညီညာစွာ ဖြန့်ဝေမထားပါ။ နောက်ဆက်တွဲ စမ်းသပ်ချက်များတွင်၊ GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ၏ အလွန်အကျွံဖော်ပြမှုသည် hypocotyls ရှိ qmRGA ၏ ပြင်ပ GA အသုံးချမှုအပေါ် အာရုံခံနိုင်စွမ်းကို တိုးစေကြောင်းလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 3d၊ e)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ hypocotyl ရှိ qd17mRGA ဖြင့် တိုင်းတာသော fluorescence သည် GA3 ကုသမှုကို အာရုံခံနိုင်စွမ်း မရှိပါ (ပုံ 3f၊ g)။ assays နှစ်ခုလုံးအတွက်၊ ပျိုးပင်များကို GA (100 μM GA3) မြင့်မားသော အာရုံစူးစိုက်မှုဖြင့် ကုသခဲ့ပြီး၊ GID1 receptor နှင့် ချိတ်ဆက်နိုင်စွမ်းကို မြှင့်တင်ခြင်း သို့မဟုတ် ဆုံးရှုံးခြင်းဖြစ်သည့် sensor ၏ လျင်မြန်သော အပြုအမူကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ ဤရလဒ်များပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် qmRGA ဇီဝအာရုံခံကိရိယာသည် GA နှင့် GA အာရုံခံကိရိယာတစ်ခုအဖြစ် ပေါင်းစပ်လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဆောင်ရွက်ကြောင်း အတည်ပြုပြီး GID1 receptor ၏ differential expression သည် အာရုံခံကိရိယာ၏ emissivity ကို သိသိသာသာ ပြုပြင်ပြောင်းလဲနိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
ယနေ့အထိ၊ SAM တွင် GA အချက်ပြမှုများ၏ ဖြန့်ဖြူးမှုသည် မရှင်းလင်းသေးပါ။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် qmRGA-expressing အပင်များနှင့် pCLV3::mCherry-NLS ပင်မဆဲလ်သတင်းထောက်35 ကို အသုံးပြု၍ L1 အလွှာ (အရေပြား၊ ပုံ 4a၊ b၊ နည်းလမ်းများနှင့် ဖြည့်စွက်နည်းလမ်းများကိုကြည့်ပါ) ကို အာရုံစိုက်၍ GA အချက်ပြမှုလှုပ်ရှားမှု၏ မြင့်မားသော resolution ပမာဏဆိုင်ရာမြေပုံများကို တွက်ချက်ခဲ့သည်။ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် L1 သည် SAM ကြီးထွားမှုကို ထိန်းချုပ်ရာတွင် အဓိကအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ဤနေရာတွင်၊ pCLV3::mCherry-NLS ဖော်ပြမှုသည် GA အချက်ပြမှုလှုပ်ရှားမှု၏ spatiotemporal ဖြန့်ဖြူးမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် ပုံသေ geometric reference point37 ကို ပံ့ပိုးပေးခဲ့သည်။ GA သည် lateral organ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွက် မရှိမဖြစ်လိုအပ်သည်ဟု ယူဆသော်လည်း၊ P3 အဆင့်မှစတင်၍ floral primordium (P) တွင် GA အချက်ပြမှုများသည် နိမ့်ကျနေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 4a၊ b)၊ ငယ်ရွယ်သော P1 နှင့် P2 primordium များသည် အလယ်ပိုင်းဒေသနှင့်ဆင်တူသော အလယ်အလတ်လှုပ်ရှားမှုရှိသည် (ပုံ 4a၊ b)။ ပိုမိုမြင့်မားသော GA အချက်ပြမှုလှုပ်ရှားမှုကို ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါ primordium နယ်နိမိတ်များတွင်၊ P1/P2 (နယ်နိမိတ်၏ဘေးနှစ်ဖက်တွင်) မှစတင်၍ P4 တွင်အထွတ်အထိပ်သို့ရောက်ရှိပြီး primordia အကြားတည်ရှိသော peripheral ဒေသရှိဆဲလ်အားလုံးတွင်တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ ၄က၊ ခ နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ ၈က၊ ခ)။ ဤပိုမိုမြင့်မားသော GA အချက်ပြမှုလှုပ်ရှားမှုကို epidermis တွင်သာမက L2 နှင့် အပေါ်ပိုင်း L3 အလွှာများတွင်ပါ တွေ့ရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၈ခ)။ qmRGA ကို အသုံးပြု၍ SAM တွင် ရှာဖွေတွေ့ရှိသော GA အချက်ပြမှုပုံစံသည်လည်း အချိန်နှင့်အမျှ မပြောင်းလဲဘဲရှိနေခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၈ဂ-f၊ k)။ qd17mRGA တည်ဆောက်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့အသေးစိတ်ဖော်ပြထားသော လွတ်လပ်သောမျဉ်းငါးခုမှ T3 အပင်များ၏ SAM တွင် စနစ်တကျ downregulated လုပ်ခဲ့သော်လည်း၊ pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP တည်ဆောက်မှုဖြင့်ရရှိသော fluorescence ပုံစံများကို ကျွန်ုပ်တို့ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၈ဂ-j၊ l)။ ဤထိန်းချုပ်မှုလိုင်းတွင် SAM တွင် fluorescence ratio တွင် အနည်းငယ်သာပြောင်းလဲမှုများကို တွေ့ရှိခဲ့ရသော်လည်း SAM အလယ်ဗဟိုတွင် TagBFP နှင့်ဆက်စပ်သော VENUS တွင် ရှင်းလင်းပြီး မမျှော်လင့်ထားသော ကျဆင်းမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ရသည်။ ၎င်းက qmRGA မှ လေ့လာတွေ့ရှိရသော signaling pattern သည် mRGA-VENUS ၏ GA-dependent degradation ကို ထင်ဟပ်စေကြောင်း အတည်ပြုသော်လည်း qmRGA သည် meristem အလယ်ဗဟိုတွင် GA signaling activity ကို အလွန်အကျွံ ခန့်မှန်းနိုင်ကြောင်းလည်း ပြသသည်။ အကျဉ်းချုပ်အားဖြင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် primordia ၏ ဖြန့်ဖြူးမှုကို အဓိကအားဖြင့် ထင်ဟပ်စေသော GA signaling pattern တစ်ခုကို ဖော်ပြသည်။ inter-primordial region (IPR) ၏ ဤဖြန့်ဖြူးမှုသည် ဖွံ့ဖြိုးဆဲ primordium နှင့် အလယ်ဗဟိုဒေသအကြားတွင် မြင့်မားသော GA signaling activity တဖြည်းဖြည်း ဖြစ်ပေါ်လာခြင်းကြောင့်ဖြစ်ပြီး တစ်ချိန်တည်းမှာပင် primordium ရှိ GA signaling activity လျော့ကျသွားသည် (ပုံ ၄ဂ၊ ဃ)။
GID1b နှင့် GID1c receptors များ၏ ဖြန့်ဖြူးမှု (အထက်တွင်ကြည့်ပါ) သည် GA receptors များ၏ ကွဲပြားသော ဖော်ပြမှုသည် SAM တွင် GA အချက်ပြမှု လှုပ်ရှားမှုပုံစံကို ပုံဖော်ရာတွင် အထောက်အကူပြုကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ GA ၏ ကွဲပြားသော စုဆောင်းမှု ပါဝင်ပတ်သက်မှု ရှိ၊ မရှိကို ကျွန်ုပ်တို့ စူးစမ်းလေ့လာခဲ့ပါသည်။ ဤဖြစ်နိုင်ခြေကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် nlsGPS1 GA FRET sensor21 ကို အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ 10 μM GA4+7 ဖြင့် 100 မိနစ်ကြာ ကုသထားသော nlsGPS1 ၏ SAM တွင် activation frequency မြင့်တက်လာသည်ကို တွေ့ရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 9a–e)၊ ၎င်းသည် roots21 တွင်ကဲ့သို့ပင် SAM ရှိ GA ပါဝင်မှုပြောင်းလဲမှုများကို nlsGPS1 တုံ့ပြန်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ nlsGPS1 activation frequency ၏ နေရာဒေသ ဖြန့်ဖြူးမှုက SAM ၏ အပြင်ဘက်အလွှာများတွင် GA အဆင့် အတော်လေး နိမ့်ကျကြောင်း ဖော်ထုတ်ပြသခဲ့သော်လည်း ၎င်းတို့သည် SAM ၏ အလယ်ဗဟိုနှင့် နယ်နိမိတ်များတွင် မြင့်မားနေကြောင်း ပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 4e နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 9a,c)။ ၎င်းသည် GA သည် qmRGA မှ ဖော်ပြထားသော နေရာဒေသပုံစံနှင့် နှိုင်းယှဉ်နိုင်သော နေရာဒေသပုံစံဖြင့် SAM တွင်လည်း ဖြန့်ဝေထားကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ဖြည့်စွက်နည်းလမ်းတစ်ခုအနေဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် SAM ကို fluorescent GA (GA3-၊ GA4-၊ GA7-Fl) သို့မဟုတ် Fl တစ်မျိုးတည်းဖြင့် negative control အဖြစ်လည်း ကုသပေးခဲ့ပါသည်။ Fl signal ကို အလယ်ဗဟိုဒေသနှင့် primordium အပါအဝင် SAM တစ်လျှောက်လုံးတွင် ဖြန့်ဝေထားသော်လည်း ပြင်းထန်မှုနည်းပါသည် (ပုံ 4j နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 10d)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေဖြင့်၊ GA-Fl သုံးခုစလုံးသည် primordium နယ်နိမိတ်အတွင်းနှင့် IPR ၏ ကျန်အပိုင်းတွင် အတိုင်းအတာအမျိုးမျိုးဖြင့် စုပုံလာပြီး GA7-Fl သည် IPR ၏ အကြီးဆုံး domain တွင် စုပုံနေသည် (ပုံ 4k နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 10a,b)။ fluorescence intensity ကို တိုင်းတာခြင်းက Fl-treated SAM နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက IPR နှင့် non-IPR intensity ratio သည် GA-Fl-treated SAM တွင် ပိုမိုမြင့်မားကြောင်း ဖော်ထုတ်ခဲ့သည် (ပုံ 4l နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 10c)။ ဤရလဒ်များက အင်္ဂါနယ်နိမိတ်နှင့် အနီးဆုံးတွင် တည်ရှိသော IPR ဆဲလ်များတွင် GA သည် ပိုမိုမြင့်မားသော ပြင်းအားများတွင် ရှိနေကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ဒါကြောင့် SAM GA အချက်ပြမှု လှုပ်ရှားမှုပုံစံဟာ GA receptors တွေရဲ့ ကွဲပြားတဲ့ ဖော်ပြမှုနဲ့ ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါနယ်နိမိတ်တွေအနီးက IPR ဆဲလ်တွေမှာ GA ကွဲပြားတဲ့ စုဆောင်းမှု နှစ်ခုလုံးကနေ ဖြစ်ပေါ်လာတယ်လို့ အကြံပြုထားပါတယ်။ ဒါကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုက မမျှော်လင့်ထားတဲ့ spatiotemporal ပုံစံကို ဖော်ပြခဲ့ပြီး SAM ရဲ့ အလယ်ဗဟိုနဲ့ primordium မှာ လှုပ်ရှားမှုနည်းပြီး peripheral ဧရိယာမှာ IPR မှာ လှုပ်ရှားမှုများပါတယ်။
SAM တွင် မတူညီသော GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်၏ အခန်းကဏ္ဍကို နားလည်ရန်အတွက်၊ SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS ၏ real-time time-lapse imaging ကို အသုံးပြု၍ GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်၊ ဆဲလ်ချဲ့ထွင်မှုနှင့် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုအကြား ဆက်စပ်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည်။ ကြီးထွားမှုထိန်းညှိမှုတွင် GA ၏ အခန်းကဏ္ဍကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားပါက၊ ဆဲလ်ချဲ့ထွင်မှု parameters များနှင့် အပြုသဘောဆက်စပ်မှုကို မျှော်လင့်ထားပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်မြေပုံများကို ဆဲလ်မျက်နှာပြင်ကြီးထွားမှုနှုန်း၏ မြေပုံများ (ပေးထားသောဆဲလ်အတွက်နှင့် ကွဲထွက်ချိန်တွင် သမီးဆဲလ်များအတွက် ဆဲလ်ချဲ့ထွင်မှုအစွမ်းသတ္တိအတွက် ကိုယ်စားပြုအနေဖြင့်) နှင့် ဆဲလ်ချဲ့ထွင်မှု၏ ဦးတည်ချက်ကို တိုင်းတာသည့် ကြီးထွားမှု anisotropy မြေပုံများနှင့် ဦးစွာ နှိုင်းယှဉ်ခဲ့ပါသည် (ပေးထားသောဆဲလ်အတွက်နှင့် ကွဲထွက်ချိန်တွင် သမီးဆဲလ်များအတွက်လည်း ဤနေရာတွင် အသုံးပြုပါသည်။ ပုံ 5a၊b၊ နည်းလမ်းများနှင့် ဖြည့်စွက်နည်းလမ်းများကို ကြည့်ပါ)။ ကျွန်ုပ်တို့၏ SAM ဆဲလ်မျက်နှာပြင်ကြီးထွားမှုနှုန်း၏ မြေပုံများသည် ယခင်လေ့လာတွေ့ရှိချက်များနှင့် ကိုက်ညီပါသည်38,39၊ ပန်းပွင့်များတွင် အနားသတ်တွင် အနည်းဆုံးကြီးထွားမှုနှုန်းနှင့် အမြင့်ဆုံးကြီးထွားမှုနှုန်းတို့ဖြင့် (ပုံ 5a)။ အဓိကအစိတ်အပိုင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (PCA) မှ GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်သည် ဆဲလ်မျက်နှာပြင်ကြီးထွားမှုပြင်းထန်မှုနှင့် အနုတ်လက္ခဏာဆက်စပ်နေကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 5c)။ GA အချက်ပြမှုထည့်သွင်းမှုနှင့် ကြီးထွားမှုပြင်းထန်မှုအပါအဝင် ကွဲပြားမှု၏ အဓိကဝင်ရိုးများသည် CLV3 ဖော်ပြမှုမြင့်မားခြင်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်သော ဦးတည်ရာနှင့် orthogonal ဖြစ်ကြောင်းလည်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသခဲ့ပြီး ကျန်ရှိသော ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများတွင် SAM စင်တာမှ ဆဲလ်များကို ဖယ်ထုတ်ထားကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။ Spearman ဆက်စပ်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုက PCA ရလဒ်များကို အတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ 5d)၊ IPR တွင် GA အချက်ပြမှုမြင့်မားခြင်းသည် ဆဲလ်ချဲ့ထွင်မှုမြင့်မားခြင်းကို မဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ သို့သော် ဆက်စပ်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုက GA အချက်ပြမှုလှုပ်ရှားမှုနှင့် ကြီးထွားမှု anisotropy အကြား အနည်းငယ်အပြုသဘောဆောင်သော ဆက်စပ်မှုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည် (ပုံ 5c၊ d)၊ IPR တွင် GA အချက်ပြမှုမြင့်မားခြင်းသည် ဆဲလ်ကြီးထွားမှု၏ ဦးတည်ရာနှင့် ဆဲလ်ပွားပြား၏ အနေအထားကို လွှမ်းမိုးနိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
a၊ b SAM ရှိ မျက်နှာပြင်ပျမ်းမျှကြီးထွားမှု (a) နှင့် ကြီးထွားမှု anisotropy (b) ၏ အပူမြေပုံများသည် လွတ်လပ်သောအပင်ခုနစ်ပင်ပေါ်တွင် ပျမ်းမျှထားသည် (ဆဲလ်ချဲ့ထွင်မှု၏ အစွမ်းသတ္တိနှင့် ဦးတည်ရာအတွက် အသီးသီး proxy အဖြစ်အသုံးပြုသည်)။ c PCA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် အောက်ပါ variable များပါဝင်သည်- GA signal၊ မျက်နှာပြင်ကြီးထွားမှုပြင်းထန်မှု၊ မျက်နှာပြင်ကြီးထွားမှု anisotropy နှင့် CLV3 expression။ PCA အစိတ်အပိုင်း 1 သည် မျက်နှာပြင်ကြီးထွားမှုပြင်းထန်မှုနှင့် အဓိကအားဖြင့် အနုတ်လက္ခဏာဆက်စပ်နေပြီး GA signal နှင့် အပြုသဘောဆက်စပ်နေသည်။ PCA အစိတ်အပိုင်း 2 သည် မျက်နှာပြင်ကြီးထွားမှု anisotropy နှင့် အဓိကအားဖြင့် အပြုသဘောဆက်စပ်နေပြီး CLV3 expression နှင့် အနုတ်လက္ခဏာဆက်စပ်နေသည်။ ရာခိုင်နှုန်းများသည် အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုစီမှ ရှင်းပြထားသော ကွဲပြားမှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။ d CZ မှလွဲ၍ တစ်ရှူးစကေးတွင် GA signal၊ မျက်နှာပြင်ကြီးထွားမှုပြင်းထန်မှုနှင့် မျက်နှာပြင်ကြီးထွားမှု anisotropy အကြား Spearman correlation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ ညာဘက်ရှိ နံပါတ်သည် variable နှစ်ခုအကြား Spearman rho တန်ဖိုးဖြစ်သည်။ ကြယ်ပွင့်များသည် correlation/negative correlation သည် အလွန်အရေးကြီးသော ကိစ္စရပ်များကို ညွှန်ပြသည်။ e confocal microscopy ဖြင့် Col-0 SAM L1 ဆဲလ်များ၏ 3D visualization။ 10 နာရီတွင် SAM (သို့သော် primordium မဟုတ်ပါ) တွင် ဖွဲ့စည်းထားသော ဆဲလ်နံရံအသစ်များကို ၎င်းတို့၏ ထောင့်တန်ဖိုးများအလိုက် အရောင်ခြယ်ထားသည်။ အရောင်ဘားကို အောက်ညာဘက်ထောင့်တွင် ပြသထားသည်။ အတွင်းထည့်သွင်းမှုသည် 0 h တွင် သက်ဆိုင်ရာ 3D ပုံကို ပြသထားသည်။ စမ်းသပ်မှုကို နှစ်ကြိမ်ထပ်လုပ်ခဲ့ပြီး အလားတူရလဒ်များ ရရှိခဲ့သည်။ f Box plot များသည် IPR နှင့် non-IPR Col-0 SAM (n = 10 independent plants) တွင် ဆဲလ်ကွဲနှုန်းကို ပြသသည်။ အလယ်မျဉ်းသည် median ကိုပြသပြီး box boundary များသည် 25th နှင့် 75th percentiles များကို ညွှန်ပြသည်။ Whiskers များသည် R software ဖြင့် ဆုံးဖြတ်ထားသော အနိမ့်ဆုံးနှင့် အမြင့်ဆုံးတန်ဖိုးများကို ညွှန်ပြသည်။ P တန်ဖိုးများကို Welch ၏ two-tailed t-test ဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။ g, h (g) SAM ၏ အလယ်ဗဟိုမှ radial direction နှင့် ပတ်သက်၍ ဆဲလ်နံရံအသစ် (magenta) ၏ထောင့်ကို မည်သို့တိုင်းတာရမည်ကို ပြသသည့် Schematic diagram (အဖြူရောင် dotted line) (acute angle values၊ ဆိုလိုသည်မှာ 0–90° ကိုသာ ထည့်သွင်းစဉ်းစားသည်) နှင့် (h) meristem အတွင်းရှိ circumferential/lateral နှင့် radial directions များကို ပြသသည်။ i SAM (dark blue)၊ IPR (medium blue) နှင့် non-IPR (light blue) တို့တွင် ဆဲလ်ကွဲ မျက်နှာပြင် orientation ၏ frequency histograms များ အသီးသီး။ P တန်ဖိုးများကို အမြီးနှစ်ချောင်းပါ Kolmogorov-Smirnov စမ်းသပ်မှုဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။ စမ်းသပ်မှုကို နှစ်ကြိမ်ထပ်ခါတလဲလဲပြုလုပ်ခဲ့ပြီး အလားတူရလဒ်များရရှိခဲ့သည်။ j P3 (အစိမ်းဖျော့)၊ P4 (အလတ်စားအစိမ်း) နှင့် P5 (အစိမ်းရင့်) အသီးသီးတစ်ဝိုက်ရှိ IPR ၏ ဆဲလ်ကွဲပြားမှုပြင်ညီဦးတည်ချက်၏ ကြိမ်နှုန်းဟစ်စတိုဂရမ်များ။ P တန်ဖိုးများကို အမြီးနှစ်ချောင်းပါ Kolmogorov-Smirnov စမ်းသပ်မှုဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။ စမ်းသပ်မှုကို နှစ်ကြိမ်ထပ်ခါတလဲလဲပြုလုပ်ခဲ့ပြီး အလားတူရလဒ်များရရှိခဲ့သည်။
ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် assay အတွင်း အသစ်ဖွဲ့စည်းထားသော ဆဲလ်နံရံများကို ဖော်ထုတ်ခြင်းဖြင့် GA အချက်ပြမှုနှင့် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုလုပ်ဆောင်ချက်အကြား ဆက်စပ်မှုကို နောက်တစ်ကြိမ် စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည် (ပုံ 5e)။ ဤနည်းလမ်းသည် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှု၏ ကြိမ်နှုန်းနှင့် ဦးတည်ရာကို တိုင်းတာနိုင်စေခဲ့သည်။ အံ့သြစရာကောင်းသည်မှာ IPR နှင့် SAM (non-IPR၊ ပုံ 5f) ၏ ကျန်ရှိသော ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုကြိမ်နှုန်းသည် အလားတူဖြစ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ IPR နှင့် non-IPR ဆဲလ်များအကြား GA အချက်ပြမှုတွင် ကွာခြားချက်များသည် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုကို သိသိသာသာ သက်ရောက်မှုမရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ၎င်းနှင့် GA အချက်ပြမှုနှင့် ကြီးထွားမှု anisotropy အကြား အပြုသဘောဆက်စပ်မှုသည် GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်သည် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှု မျက်နှာပြင်၏ ဦးတည်ရာကို လွှမ်းမိုးနိုင်မနိုင် စဉ်းစားရန် ကျွန်ုပ်တို့အား တွန်းအားပေးခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆဲလ်နံရံအသစ်၏ አዲስ ဦးတည်ချက်ကို meristem အလယ်ဗဟိုနှင့် ဆဲလ်နံရံအသစ်၏ အလယ်ဗဟိုကို ဆက်သွယ်ပေးသော radial axis နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင် acute angle အဖြစ် တိုင်းတာခဲ့သည် (ပုံ 5e-i)၊ radial axis နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင် ဆဲလ်များသည် 90° နှင့်နီးစပ်သော angle များတွင် ကွဲထွက်ရန် ထင်ရှားသော သဘောထားကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ အမြင့်ဆုံးကြိမ်နှုန်းများကို 70–80° (23.28%) နှင့် 80–90° (22.62%) (ပုံ 5e,i) တွင် တွေ့ရှိခဲ့ရပြီး၊ circumferential/transverse direction ရှိ ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုနှင့် ကိုက်ညီပါသည် (ပုံ 5h)။ ဤဆဲလ်ကွဲထွက်မှုအပြုအမူအပေါ် GA signaling ၏ ပံ့ပိုးမှုကို စစ်ဆေးရန်အတွက်၊ IPR နှင့် non-IPR ရှိ ဆဲလ်ကွဲထွက်မှု parameters များကို သီးခြားစီ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည် (ပုံ 5i)။ IPR ဆဲလ်များရှိ ပိုင်းခြားထောင့်ဖြန့်ဖြူးမှုသည် IPR မဟုတ်သောဆဲလ်များ သို့မဟုတ် SAM တစ်ခုလုံးရှိဆဲလ်များနှင့် ကွဲပြားကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ သတိပြုမိခဲ့ပြီး၊ IPR ဆဲလ်များသည် ဘေးတိုက်/စက်ဝိုင်းပုံဆဲလ်ကွဲပွားမှု အချိုးအစားမြင့်မားကြောင်း၊ ဆိုလိုသည်မှာ 70–80° နှင့် 80–90° (သက်ဆိုင်ရာအချိုးအစား 33.86% နှင့် 30.71% အသီးသီး) ကို ပြသထားသည် (ပုံ 5i)။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာတွေ့ရှိချက်များအရ မြင့်မားသော GA အချက်ပြမှုနှင့် GA အချက်ပြမှုလှုပ်ရှားမှုနှင့် ကြီးထွားမှု anisotropy အကြား ဆက်စပ်မှုနှင့်ဆင်တူသော ဆဲလ်ကွဲပွားမှု မျက်နှာပြင်ဦးတည်ချက်တို့အကြား ဆက်စပ်မှုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည် (ပုံ 5c၊ d)။ ဤဆက်စပ်မှု၏ နေရာဒေသ ထိန်းသိမ်းမှုကို ပိုမိုခိုင်မာစေရန်အတွက်၊ P3 မှစတင်၍ primordium ကိုဝန်းရံထားသော IPR ဆဲလ်များတွင် ပိုင်းခြားမျက်နှာပြင်ဦးတည်ချက်ကို တိုင်းတာခဲ့သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် P4 မှစတင်၍ ဤဒေသတွင် အမြင့်ဆုံး GA အချက်ပြမှုလှုပ်ရှားမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သောကြောင့်ဖြစ်သည် (ပုံ 4)။ P3 နှင့် P4 ပတ်လည်ရှိ IPR ၏ ပိုင်းခြားထောင့်များသည် စာရင်းအင်းအရ သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များ မပြသသော်လည်း၊ P4 ပတ်လည်ရှိ IPR တွင် ဘေးတိုက်ဆဲလ်ကွဲပွားမှုကြိမ်နှုန်း မြင့်တက်လာသည်ကို တွေ့ရှိရသည် (ပုံ 5j)။ သို့သော် P5 ပတ်လည်ရှိ IPR ဆဲလ်များတွင် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှု မျက်နှာပြင်၏ ဦးတည်ချက် ကွာခြားချက်သည် စာရင်းအင်းအရ သိသာထင်ရှားလာပြီး transverse ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုကြိမ်နှုန်းတွင် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာသည် (ပုံ 5j)။ ဤရလဒ်များ ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင် GA အချက်ပြမှုသည် SAM တွင် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှု၏ ဦးတည်ချက်ကို ထိန်းချုပ်နိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားပြီး၊ မြင့်မားသော GA အချက်ပြမှုသည် IPR တွင် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှု၏ ဘေးတိုက် ဦးတည်ချက်ကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်ဟူသော ယခင်အစီရင်ခံစာများနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။
IPR ရှိဆဲလ်များသည် primordia တွင်မဟုတ်ဘဲ internodes2,42,43 တွင်ပေါင်းစပ်မည်ဟုခန့်မှန်းရသည်။ IPR ရှိဆဲလ်ကွဲခြင်း၏ transverse orientation သည် internodes များတွင် epidermal ဆဲလ်များ၏ parallel longitudinal rows များ၏ပုံမှန်စီစဉ်မှုကိုဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။ အထက်တွင်ဖော်ပြထားသောကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာတွေ့ရှိချက်များအရ GA အချက်ပြမှုသည် ဆဲလ်ကွဲခြင်း၏ဦးတည်ချက်ကိုထိန်းညှိပေးခြင်းဖြင့် ဤလုပ်ငန်းစဉ်တွင်အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှပါဝင်နိုင်ဖွယ်ရှိကြောင်းအကြံပြုထားသည်။
DELLA မျိုးဗီဇအများအပြား၏ လုပ်ဆောင်ချက်ဆုံးရှုံးမှုသည် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံ GA တုံ့ပြန်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး ဤယူဆချက်ကို စမ်းသပ်ရန် della မျိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုများကို အသုံးပြုနိုင်သည်44။ ကျွန်ုပ်တို့သည် SAM တွင် DELLA မျိုးဗီဇငါးခု၏ ဖော်ပြမှုပုံစံများကို ဦးစွာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ GUS လိုင်း၏ Transcriptional fusion45 မှ GAI၊ RGA၊ RGL1 နှင့် RGL2 (အလွန်နည်းပါးသောအတိုင်းအတာအထိ) ကို SAM တွင် ဖော်ပြခဲ့ကြောင်း ဖော်ပြခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 11a–d)။ In situ hybridization မှ GAI mRNA သည် primordia နှင့် ဖွံ့ဖြိုးဆဲပန်းများတွင် အထူးသဖြင့် စုပုံနေကြောင်း ထပ်မံပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 11e)။ RGL1 နှင့် RGL3 mRNA ကို SAM canopy တစ်လျှောက်နှင့် အသက်ကြီးပန်းများတွင် တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ RGL2 mRNA သည် နယ်စပ်ဒေသတွင် ပိုမိုများပြားသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 11f–h)။ pRGL3::RGL3-GFP SAM ၏ Confocal imaging သည် in situ hybridization ဖြင့် တွေ့ရှိရသည့် ဖော်ပြမှုကို အတည်ပြုပြီး RGL3 ပရိုတင်းသည် SAM ၏ အလယ်ဗဟိုတွင် စုပုံနေကြောင်း ပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 11i)။ pRGA::GFP-RGA လိုင်းကို အသုံးပြုခြင်းအားဖြင့်၊ RGA ပရိုတင်းသည် SAM တွင် စုပုံလာသော်လည်း P4 မှစတင်၍ နယ်နိမိတ်တွင် ၎င်း၏ပမာဏ လျော့နည်းသွားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 11j)။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ qmRGA မှ ထောက်လှမ်းရရှိသည့်အတိုင်း RGL3 နှင့် RGA ၏ ဖော်ပြမှုပုံစံများသည် IPR တွင် မြင့်မားသော GA အချက်ပြမှုလှုပ်ရှားမှုနှင့် ကိုက်ညီပါသည် (ပုံ ၄)။ ထို့အပြင်၊ ဤဒေတာသည် DELLA အားလုံးကို SAM တွင် ဖော်ပြထားပြီး ၎င်းတို့၏ ဖော်ပြမှုသည် SAM တစ်ခုလုံးကို ပေါင်းစပ်လွှမ်းခြုံထားကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
ထို့နောက် wild-type SAM (Ler, control) နှင့် gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants များတွင် ဆဲလ်ကွဲပွားမှု parameters များကို ကျွန်ုပ်တို့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည် (ပုံ 6a, b)။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက wild type နဲ့ နှိုင်းယှဉ်ရင် della global mutant SAM မှာ ဆဲလ်ကွဲပွားမှုထောင့်ကြိမ်နှုန်းတွေရဲ့ ဖြန့်ဖြူးမှုမှာ စာရင်းအင်းအရ သိသာထင်ရှားတဲ့ ပြောင်းလဲမှုတစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ရပါတယ် (ပုံ 6c)။ della global mutant မှာ ဒီပြောင်းလဲမှုဟာ 80–90° ထောင့် (34.71% vs. 24.55%) ကြိမ်နှုန်းနဲ့ 70–80° ထောင့် (23.78% vs. 20.18%) တိုးလာခြင်းကြောင့်ဖြစ်ပြီး၊ ဆိုလိုသည်မှာ transverse cell divisions နဲ့ ကိုက်ညီပါတယ် (ပုံ 6c)။ non-transverse divisions (0–60°) ရဲ့ ကြိမ်နှုန်းဟာ della global mutant မှာလည်း နည်းပါးပါတယ် (ပုံ 6c)။ della global mutant ၏ SAM တွင် transverse cell division များ၏ frequency သိသိသာသာ မြင့်တက်လာခဲ့သည် (ပုံ 6b)။ IPR ရှိ transverse cell division များ၏ frequency သည် wild type နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက della global mutant တွင်လည်း ပိုမိုမြင့်မားခဲ့သည် (ပုံ 6d)။ IPR ဒေသပြင်ပတွင် wild type တွင် cell division angles များ၏ ပိုမိုတပြေးညီ ဖြန့်ဖြူးမှုရှိပြီး della global mutant သည် IPR ကဲ့သို့သော tangential divisions များကို ပိုနှစ်သက်သည် (ပုံ 6e)။ GA စုပုံသည့် GA-inactive mutant background ဖြစ်သော ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1၊ ga2ox2-1၊ ga2ox3-1၊ ga2ox4-1 နှင့် ga2ox6-2) ၏ SAM ရှိ cell divisions များ၏ orientation ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွက်ချက်ခဲ့ပါသည်။ GA အဆင့်များ တိုးလာသည်နှင့်အညီ၊ ငါးပွင့်တွဲ ga2ox မျိုးဗီဇပြောင်းလဲမှု ပန်းပွင့်၏ SAM သည် Col-0 ထက် ပိုကြီးသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 12a၊ b)၊ Col-0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ငါးပွင့်တွဲ ga2ox SAM သည် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုထောင့်များ၏ သိသာထင်ရှားသော ကွဲပြားသော ဖြန့်ဖြူးမှုကို ပြသခဲ့ပြီး၊ ထောင့်ကြိမ်နှုန်းသည် 50° မှ 90° အထိ တိုးလာပြီး ဆိုလိုသည်မှာ tangential ကွဲထွက်မှုများကို ထပ်မံအားပေးသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 12a–c)။ ထို့ကြောင့်၊ GA အချက်ပြမှုနှင့် GA စုဆောင်းမှု၏ ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံ လှုံ့ဆော်မှုသည် IPR နှင့် SAM ၏ ကျန်အပိုင်းတွင် lateral cell ကွဲထွက်မှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ပြသပါသည်။
a, b confocal microscopy ကို အသုံးပြု၍ PI-stained Ler (a) နှင့် global della mutant (b) SAM ၏ L1 အလွှာကို 3D visualization ပြုလုပ်ထားသည်။ SAM (သို့သော် primordium မဟုတ်ပါ) တွင် ၁၀ နာရီကြာ ဖွဲ့စည်းထားသော ဆဲလ်နံရံအသစ်များကို ပြသပြီး ၎င်းတို့၏ထောင့်တန်ဖိုးများအလိုက် အရောင်ခြယ်ထားသည်။ inset သည် 0 နာရီတွင် SAM ကို ပြသထားသည်။ အရောင်ဘားကို အောက်ညာဘက်ထောင့်တွင် ပြသထားသည်။ (b) ရှိ မြှားသည် global della mutant ရှိ alignmented cell files များ၏ ဥပမာကို ညွှန်ပြသည်။ စမ်းသပ်မှုကို အလားတူရလဒ်များဖြင့် နှစ်ကြိမ်ထပ်လုပ်ခဲ့သည်။ ce Ler နှင့် global della အကြား SAM တစ်ခုလုံး (d), IPR (e) နှင့် non-IPR (f) ရှိ cell division plane orientations များ၏ frequency distribution ကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်း။ p တန်ဖိုးများကို two-tailed Kolmogorov-Smirnov စမ်းသပ်မှုကို အသုံးပြု၍ ရရှိခဲ့သည်။ f, g Col-0 (i) နှင့် pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenic အပင်များ၏ PI-stained SAM ၏ confocal ရုပ်ပုံများ၏ 3D visualization။ ပြားများ (a, b) သည် SAM တွင် ၁၀ နာရီအတွင်း ဖွဲ့စည်းထားသော ဆဲလ်နံရံအသစ်များ (သို့သော် primordia မဟုတ်ပါ) ကို ပြသထားသည်။ စမ်းသပ်မှုကို အလားတူရလဒ်များဖြင့် နှစ်ကြိမ်ထပ်လုပ်ခဲ့သည်။ h–j Col-0 နှင့် pCUC2::gai-1-VENUS အပင်များအကြား SAM (h)၊ IPR (i) နှင့် non-IPR (j) တွင်တည်ရှိသော ဆဲလ်ကွဲပြား ဦးတည်ချက်များ၏ ကြိမ်နှုန်းဖြန့်ဖြူးမှုကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်း။ two-tailed Kolmogorov–Smirnov စမ်းသပ်မှုကို အသုံးပြု၍ P တန်ဖိုးများကို ရရှိခဲ့သည်။
နောက်တစ်ခုအနေနဲ့ IPR မှာ GA အချက်ပြမှုကို အထူးသဖြင့် ဟန့်တားခြင်းရဲ့ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ကျွန်တော်တို့ စမ်းသပ်ခဲ့ပါတယ်။ ဒီအတွက်၊ VENUS နဲ့ ပေါင်းစပ်ထားတဲ့ dominant negative gai-1 ပရိုတိန်းရဲ့ expression ကို မောင်းနှင်ဖို့ cotyledon cup 2 (CUC2) promoter ကို အသုံးပြုခဲ့ပါတယ် (pCUC2::gai-1-VENUS လိုင်းမှာ)။ wild-type SAM မှာ၊ CUC2 promoter က P4 ကနေစပြီး border cell တွေအပါအဝင် SAM မှာ IPR အများစုရဲ့ expression ကို မောင်းနှင်ပြီး pCUC2::gai-1-VENUS အပင်တွေမှာ အလားတူ specific expression ကို တွေ့ရှိခဲ့ရပါတယ် (အောက်မှာကြည့်ပါ)။ pCUC2::gai-1-VENUS အပင်တွေရဲ့ SAM သို့မဟုတ် IPR တစ်လျှောက် ဆဲလ်ကွဲထောင့်တွေရဲ့ ဖြန့်ဖြူးမှုဟာ wild type နဲ့ သိသိသာသာ မကွာခြားပါဘူး၊ ဒါပေမယ့် မမျှော်လင့်ဘဲ ဒီအပင်တွေမှာ IPR မပါတဲ့ ဆဲလ်တွေဟာ 80–90° (ပုံ 6f–j) မြင့်မားတဲ့ frequency မှာ ကွဲနေတာကို ကျွန်တော်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်။
ဆဲလ်ကွဲပွားမှု ဦးတည်ရာသည် SAM ၏ geometry ပေါ်တွင် မူတည်ကြောင်း၊ အထူးသဖြင့် တစ်ရှူးကွေးညွှတ်မှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော tensile stress46 ပေါ်တွင် မူတည်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ထို့ကြောင့် della global mutant နှင့် pCUC2::gai-1-VENUS အပင်များတွင် SAM ၏ပုံသဏ္ဍာန် ပြောင်းလဲသွားခြင်း ရှိ၊ မရှိကို ကျွန်ုပ်တို့ မေးမြန်းခဲ့ပါသည်။ ယခင်က ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း12၊ della global mutant SAM ၏ အရွယ်အစားသည် wild type ထက် ပိုကြီးပါသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 13a၊ b၊ d)။ CLV3 နှင့် STM RNA ၏ in situ hybridization သည် della mutants များတွင် meristem ချဲ့ထွင်မှုကို အတည်ပြုပြီး stem cell niche ၏ lateral ချဲ့ထွင်မှုကို ထပ်မံပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 13e၊ f၊ h၊ i)။ သို့သော် SAM ကွေးညွှတ်မှုသည် genotype နှစ်ခုလုံးတွင် အလားတူဖြစ်သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 13k၊ m၊ n၊ p)။ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant တွင် အလားတူအရွယ်အစားတိုးလာမှုကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပြီး wild type နှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက curvature မပြောင်းလဲပါ (နောက်ဆက်တွဲပုံ 13c၊ d၊ g၊ j၊ l၊ o၊ p)။ della quadruple mutant တွင်လည်း ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုဦးတည်ချက်၏ကြိမ်နှုန်းကို သက်ရောက်မှုရှိသော်လည်း della monolithic mutant ထက် နည်းပါးပါသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 12d–f)။ ဤဆေးပမာဏအကျိုးသက်ရောက်မှုသည် curvature အပေါ် သက်ရောက်မှုမရှိခြင်းနှင့်အတူ Della quadruple mutant ရှိ ကျန်ရှိသော RGL3 လုပ်ဆောင်ချက်သည် DELLA လုပ်ဆောင်ချက်ဆုံးရှုံးမှုကြောင့် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုဦးတည်ချက်ပြောင်းလဲမှုများကို ကန့်သတ်ထားပြီး lateral cell divisions များတွင် ပြောင်းလဲမှုများသည် SAM geometry ပြောင်းလဲမှုထက် GA signaling activity ပြောင်းလဲမှုများကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် ဖြစ်ပေါ်လာကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ CUC2 promoter သည် P4 မှစတင်၍ SAM တွင် IPR expression ကို မောင်းနှင်သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 14a၊ b)၊ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေဖြင့်၊ pCUC2::gai-1-VENUS SAM သည် အရွယ်အစားသေးငယ်သော်လည်း curvature ပိုများသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 14c–h)။ pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology ရှိ ဤပြောင်းလဲမှုသည် wild type နှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက mechanical stresses များ၏ ဖြန့်ဖြူးမှုကွဲပြားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်ပြီး၊ ၎င်းတွင် မြင့်မားသော circumferential stresses များသည် SAM center47 မှ ပိုတိုသောအကွာအဝေးတွင် စတင်သည်။ တနည်းအားဖြင့်၊ pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology ရှိ ပြောင်းလဲမှုများသည် transgene expression48 မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော ဒေသတွင်း mechanical properties များတွင် ပြောင်းလဲမှုများမှတစ်ဆင့် ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်သည်။ နှစ်ခုစလုံးတွင်၊ ၎င်းသည် ဆဲလ်များသည် circumferential/transverse orientation တွင် ပိုင်းခြားနိုင်ခြေကို တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် GA signaling တွင် ပြောင်းလဲမှုများ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း လျော့ပါးစေနိုင်ပြီး ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာတွေ့ရှိချက်များကို ရှင်းပြသည်။
ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ ဒေတာတွေ အားလုံးပေါင်းလိုက်ရင် GA အချက်ပြမှု မြင့်မားခြင်းဟာ IPR မှာ ဆဲလ်ပွားပြားရဲ့ ဘေးတိုက်ဦးတည်ချက်မှာ တက်ကြွတဲ့ အခန်းကဏ္ဍကနေ ပါဝင်တယ်ဆိုတာ အတည်ပြုပါတယ်။ ဒါ့အပြင် meristem curvature ဟာ IPR မှာ ဆဲလ်ပွားပြားရဲ့ ဦးတည်ချက်ကိုလည်း လွှမ်းမိုးမှုရှိတယ်လို့လည်း ပြသပါတယ်။
GA အချက်ပြမှု လှုပ်ရှားမှု မြင့်မားခြင်းကြောင့် IPR ရှိ ပိုင်းခြားမျက်နှာပြင်၏ ထောင့်ဖြတ်ဦးတည်ချက်သည် GA သည် SAM အတွင်းရှိ အရေပြားအပေါ်ယံလွှာရှိ radial cell file ကို ကြိုတင်စီစဉ်ထားပြီး ၎င်းကို အရေပြား internode တွင် နောက်ပိုင်းတွင် တွေ့ရှိနိုင်မည့် ဆဲလ်ဖွဲ့စည်းပုံကို သတ်မှတ်ပေးသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ အမှန်စင်စစ်၊ ထိုကဲ့သို့သော ဆဲလ်ဖိုင်များကို della global mutants များ၏ SAM ပုံများတွင် မကြာခဏ မြင်တွေ့ရလေ့ရှိသည် (ပုံ 6b)။ ထို့ကြောင့် SAM ရှိ GA အချက်ပြမှု၏ spatial pattern ၏ ဖွံ့ဖြိုးမှုဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ပိုမိုစူးစမ်းလေ့လာရန်အတွက်၊ wild-type (Ler နှင့် Col-0)၊ della global mutants နှင့် pCUC2::gai-1-VENUS transgenic အပင်များတွင် IPR ရှိ ဆဲလ်များ၏ spatial ဖွဲ့စည်းပုံကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် time-lapse imaging ကို အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။
IPR ရှိ GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်သည် P1/P2 မှ P4 တွင် တိုးလာပြီး အမြင့်ဆုံးသို့ရောက်ရှိခဲ့ကြောင်း qmRGA မှပြသခဲ့ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ဤပုံစံသည် အချိန်နှင့်အမျှ မပြောင်းလဲဘဲရှိနေခဲ့သည် (ပုံ 4a–f နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 8c–f၊ k)။ GA အချက်ပြမှု တိုးလာခြင်းနှင့်အတူ IPR ရှိဆဲလ်များ၏ နေရာချထားမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက်၊ ပထမဆုံးလေ့လာတွေ့ရှိပြီးနောက် ၃၄ နာရီအကြာတွင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားသော ၎င်းတို့၏ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကံကြမ္မာအရ P4 ၏အထက်နှင့် ဘေးနှစ်ဖက်တွင် Ler IPR ဆဲလ်များကို အမည်တပ်ထားပြီး၊ ဆိုလိုသည်မှာ plastid အချိန်နှစ်ကြိမ်ထက်ပို၍ P1/P2 မှ P4 အထိ primordium ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွင်း IPR ဆဲလ်များကို ကျွန်ုပ်တို့လိုက်နာနိုင်စေပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် မတူညီသောအရောင်သုံးမျိုးကို အသုံးပြုခဲ့သည်- P4 အနီးရှိ primordium ထဲသို့ ပေါင်းစပ်ထားသောဆဲလ်များအတွက် အဝါရောင်၊ IPR တွင်ရှိသောဆဲလ်များအတွက် အစိမ်းရောင်နှင့် လုပ်ငန်းစဉ်နှစ်ခုလုံးတွင် ပါဝင်သောဆဲလ်များအတွက် ခရမ်းရောင် (ပုံ 7a–c)။ t0 (0 h) တွင်၊ P4 ၏ရှေ့တွင် IPR ဆဲလ် ၁-၂ အလွှာကို မြင်နိုင်သည် (ပုံ 7a)။ မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း ဤဆဲလ်များ ပိုင်းခြားသောအခါ ၎င်းတို့သည် အဓိကအားဖြင့် transverse division plane မှတစ်ဆင့် ပိုင်းခြားခဲ့ကြသည် (ပုံ 7a-c)။ Col-0 SAM (Ler ရှိ P4 နှင့် ဆင်တူသော အနားသတ်များသည် P3 ကို အာရုံစိုက်ခြင်း) ကို အသုံးပြု၍ အလားတူရလဒ်များ ရရှိခဲ့သော်လည်း ဤ genotype တွင် ပန်းပွင့်အနားသတ်တွင် ဖြစ်ပေါ်လာသော အတွန့်သည် IPR ဆဲလ်များကို ပိုမိုမြန်ဆန်စွာ ဖုံးကွယ်ထားသည် (ပုံ 7g-i)။ ထို့ကြောင့် IPR ဆဲလ်များ၏ ပိုင်းခြားမှုပုံစံသည် ဆဲလ်များကို internodes များကဲ့သို့ radial rows များအဖြစ် ကြိုတင်စီစဉ်ပေးသည်။ radial rows များ၏ စီစဉ်မှုနှင့် အဆက်ဆက်သော အင်္ဂါများအကြား IPR ဆဲလ်များ၏ localization သည် ဤဆဲလ်များသည် internodal progenitors များဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုသည်။
ဤနေရာတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ratiometric GA signaling biosensor၊ qmRGA ကို တီထွင်ခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် endogenous signaling pathways များနှင့် အနှောင့်အယှက်ကို အနည်းဆုံးဖြစ်စေပြီး ပေါင်းစပ်ထားသော GA နှင့် GA receptor အာရုံစူးစိုက်မှုများမှ ဖြစ်ပေါ်လာသော GA signaling activity ကို ပမာဏဆိုင်ရာ mapping ပြုလုပ်နိုင်စေပြီး ဆဲလ်အဆင့်တွင် GA function အကြောင်း အချက်အလက်များကို ပေးစွမ်းပါသည်။ ဤရည်ရွယ်ချက်အတွက်၊ DELLA အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု မိတ်ဖက်များကို ချည်နှောင်နိုင်စွမ်း ဆုံးရှုံးသွားသော်လည်း GA ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော proteolysis ကို အာရုံခံနိုင်စွမ်းရှိသော ပြုပြင်ထားသော DELLA ပရိုတိန်း mRGA ကို ကျွန်ုပ်တို့ တည်ဆောက်ခဲ့ပါသည်။ qmRGA သည် GA အဆင့်များရှိ exogenous နှင့် endogenous ပြောင်းလဲမှုများ နှစ်မျိုးလုံးကို တုံ့ပြန်ပြီး ၎င်း၏ dynamic sensing ဂုဏ်သတ္တိများသည် ဖွံ့ဖြိုးမှုကာလအတွင်း GA signaling activity တွင် spatiotemporal ပြောင်းလဲမှုများကို အကဲဖြတ်နိုင်စေပါသည်။ qmRGA သည် အလွန်ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်ရှိသော ကိရိယာတစ်ခုလည်းဖြစ်ပြီး၊ ၎င်း၏ expression အတွက် အသုံးပြုသော promoter ကို ပြောင်းလဲခြင်းဖြင့် (လိုအပ်ပါက) မတူညီသော တစ်ရှူးများနှင့် လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် ပြုလုပ်နိုင်ပြီး GA signaling pathway ၏ ထိန်းသိမ်းထားသော သဘောသဘာဝနှင့် angiosperms များတစ်လျှောက် PFYRE motif ၏ ထိန်းသိမ်းထားသော သဘောသဘာဝကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားပါက အခြားမျိုးစိတ်များသို့ လွှဲပြောင်းနိုင်ဖွယ်ရှိသည်။ ၎င်းနှင့်အညီ၊ ဆန် SLR1 DELLA ပရိုတိန်း (HYY497AAA) တွင် ညီမျှသော မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုတစ်ခုသည် SLR1 ၏ ကြီးထွားမှုကို ဖိနှိပ်ပေးသည့် လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဖိနှိပ်ပေးပြီး mRGA23 နှင့်ဆင်တူသော GA-mediated degradation ကို အနည်းငယ်သာ လျှော့ချပေးကြောင်းလည်း ပြသခဲ့သည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ Arabidopsis တွင် မကြာသေးမီက လေ့လာမှုများအရ PFYRE domain (S474L) ရှိ အမိုင်နိုအက်ဆစ် မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုတစ်ခုတည်းသည် RGA ၏ transcriptional activity ကို transcription factor partners50 နှင့် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်နိုင်စွမ်းကို မထိခိုက်စေဘဲ ပြောင်းလဲစေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ဤမျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုသည် mRGA တွင်ရှိသော အမိုင်နိုအက်ဆစ် အစားထိုးမှု ၃ မျိုးနှင့် အလွန်နီးစပ်သော်လည်း၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာမှုများအရ ဤမျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုနှစ်ခုသည် DELLA ၏ ထူးခြားသော ဝိသေသလက္ခဏာများကို ပြောင်းလဲစေကြောင်း ပြသထားသည်။ transcription factor partners အများစုသည် DELLA26,51 ၏ LHR1 နှင့် SAW domains များနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော်လည်း၊ PFYRE domain ရှိ ထိန်းသိမ်းထားသော အမိုင်နိုအက်ဆစ်အချို့သည် ဤအပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများကို တည်ငြိမ်စေရန် ကူညီပေးနိုင်ပါသည်။
အပင်ဗိသုကာနှင့် အထွက်နှုန်းတိုးတက်မှုတွင် အဓိကလက္ခဏာတစ်ရပ်မှာ အတွင်းပိုင်းဖွံ့ဖြိုးမှုဖြစ်သည်။ qmRGA သည် IPR အတွင်းပိုင်း မူလဆဲလ်များတွင် GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက် ပိုမိုမြင့်မားကြောင်း ဖော်ပြခဲ့သည်။ ပမာဏဆိုင်ရာ ရုပ်ပုံဖော်ခြင်းနှင့် မျိုးရိုးဗီဇတို့ကို ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် GA အချက်ပြမှုပုံစံများသည် SAM အရေပြားအပေါ်ယံလွှာတွင် စက်ဝိုင်း/ပြောင်းပြန်ဆဲလ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု မျက်နှာပြင်များကို ထပ်တူကျစေပြီး အတွင်းပိုင်းဖွံ့ဖြိုးမှုအတွက် လိုအပ်သော ဆဲလ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအဖွဲ့အစည်းကို ပုံဖော်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ပြသခဲ့သည်။ ဆဲလ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု မျက်နှာပြင်ဦးတည်ချက်၏ ထိန်းညှိပေးသည့်အရာများစွာကို ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကာလအတွင်း ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့သည်52,53။ ကျွန်ုပ်တို့၏လုပ်ငန်းသည် GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်သည် ဤဆဲလ် parameter ကို မည်သို့ထိန်းညှိပေးသည်ကို ရှင်းလင်းသော ဥပမာတစ်ခု ပေးပါသည်။ DELLA သည် prefolding protein complexes41 နှင့် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်နိုင်သောကြောင့် GA အချက်ပြမှုသည် cortical microtubule orientation40,41,54,55 ဆဲလ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု မျက်နှာပြင်ဦးတည်ချက်ကို တိုက်ရိုက်လွှမ်းမိုးခြင်းဖြင့် ထိန်းညှိနိုင်သည်။ SAM တွင် GA အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက် ပိုမိုမြင့်မားခြင်း၏ ဆက်စပ်မှုသည် ဆဲလ်ရှည်ခြင်း သို့မဟုတ် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းမဟုတ်ဘဲ ကြီးထွားမှု anisotropy သာဖြစ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ မမျှော်လင့်ဘဲ ပြသခဲ့ပြီး ၎င်းသည် IPR တွင် ဆဲလ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု ဦးတည်ချက်အပေါ် GA ၏ တိုက်ရိုက်အကျိုးသက်ရောက်မှုနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ သို့သော် ဤအကျိုးသက်ရောက်မှုသည် သွယ်ဝိုက်နိုင်သည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ ချန်လှပ်၍မရပါ၊ ဥပမာ GA ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသည်56။ ဆဲလ်နံရံဂုဏ်သတ္တိများပြောင်းလဲမှုများသည် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာဖိစီးမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်57,58၊ ၎င်းသည် cortical microtubules များ၏ ආරක්තරණကို သက်ရောက်မှုရှိစေသည်39,46,59။ GA မှ ආරක්තරණစက်ပိုင်းဆိုင်ရာဖိစီးမှုနှင့် GA မှ microtubule ආරක්තරණကို တိုက်ရိုက်ထိန်းညှိခြင်း၏ ပေါင်းစပ်အကျိုးသက်ရောက်မှုများသည် internodes များကို သတ်မှတ်ရန် IPR တွင် ဆဲလ်ကွဲပြားမှု ආරක්තරණ၏ သီးခြားပုံစံတစ်ခုကို ထုတ်လုပ်ရာတွင် ပါဝင်နိုင်ပြီး ဤအယူအဆကို စမ်းသပ်ရန် နောက်ထပ်လေ့လာမှုများ လိုအပ်ပါသည်။ အလားတူပင်၊ ယခင်လေ့လာမှုများသည် internode ဖွဲ့စည်းမှုကို ထိန်းချုပ်ရာတွင် DELLA-interacting ပရိုတိန်း TCP14 နှင့် 15 ၏ အရေးပါမှုကို မီးမောင်းထိုးပြခဲ့ပြီး60,61 ဤအချက်များသည် internode ဖွံ့ဖြိုးမှုကို ထိန်းညှိပေးပြီး GA အချက်ပြမှုကို လွှမ်းမိုးကြောင်းပြသထားသည့် BREVIPEDICELLUS (BP) နှင့် PENNYWISE (PNY) နှင့်အတူ GA ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ကြားခံဖြစ်စေနိုင်သည်2,62။ DELLA များသည် brassinosteroid၊ ethylene၊ jasmonic acid နှင့် abscisic acid (ABA) အချက်ပြလမ်းကြောင်းများနှင့် ဓါတ်ပြုမှု63,64 နှင့် ဤဟော်မုန်းများသည် microtubule orientation65 ကို လွှမ်းမိုးနိုင်သည်ကို ထောက်ရှုလျှင် ဆဲလ်ကွဲထွက်မှု orientation အပေါ် GA ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို အခြားဟော်မုန်းများက ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။
အစောပိုင်း ဆိုက်တိုလောဂျီ လေ့လာမှုများအရ Arabidopsis SAM ၏ အတွင်းပိုင်းနှင့် အပြင်ပိုင်း ဒေသနှစ်ခုလုံးသည် အတွင်းပိုင်း ဖွံ့ဖြိုးမှုအတွက် လိုအပ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်2,42။ GA သည် အတွင်းပိုင်းတစ်ရှူးများတွင် ဆဲလ်ကွဲပွားမှုကို တက်ကြွစွာ ထိန်းညှိပေးသည်12 ဟူသောအချက်သည် SAM ရှိ meristem နှင့် အတွင်းပိုင်း အရွယ်အစားကို ထိန်းညှိရာတွင် GA ၏ နှစ်ထပ်လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထောက်ခံသည်။ ဦးတည်ချက်ဆဲလ်ကွဲပွားမှုပုံစံကို အတွင်းပိုင်း SAM တစ်ရှူးတွင်လည်း တင်းတင်းကျပ်ကျပ် ထိန်းညှိထားပြီး ဤထိန်းညှိမှုသည် ပင်စည်ကြီးထွားမှုအတွက် မရှိမဖြစ်လိုအပ်သည်52။ GA သည် အတွင်းပိုင်း SAM အဖွဲ့အစည်းတွင် ဆဲလ်ကွဲပွားမှု မျက်နှာပြင်ကို ဦးတည်ရာတွင် အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ခြင်း ရှိ၊ မရှိ၊ ထို့ကြောင့် SAM အတွင်း အတွင်းပိုင်း အစိတ်အပိုင်းများ၏ သတ်မှတ်ချက်နှင့် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကို တစ်ပြိုင်တည်းဖြစ်အောင် လုပ်ဆောင်ခြင်း ရှိ၊ မရှိ စစ်ဆေးရန် စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းလိမ့်မည်။
အပင်များကို မြေဆီလွှာ သို့မဟုတ် 1% sucrose နှင့် 1% agar (Sigma) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသော 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) တွင် in vitro တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်၊ ၎င်းတွင် ပျိုးပင်များကို အလင်းရောင် တည်ငြိမ်သောနေရာနှင့် 22 °C အောက်တွင် ဒေါင်လိုက်ပြားများပေါ်တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည့် hypocotyl နှင့် အမြစ်ကြီးထွားမှု စမ်းသပ်မှုများမှအပ၊ နိုက်ထရိတ် စမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ နေ့တာရှည်အခြေအနေများတွင် လုံလောက်သော နိုက်ထရိတ် (0 သို့မဟုတ် 10 mM KNO3)၊ 0.5 mM NH4-succinate၊ 1% sucrose နှင့် 1% A-agar (Sigma) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသော ပြုပြင်ထားသော MS medium (bioWORLD plant medium) တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်။
pDONR221 ထဲသို့ ထည့်သွင်းထားသော GID1a cDNA ကို pDONR P4-P1R-pUBQ10 နှင့် pDONR P2R-P3-mCherry တို့နှင့် pB7m34GW ထဲသို့ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ပြီး pUBQ10::GID1a-mCherry ကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ pDONR221 ထဲသို့ ထည့်သွင်းထားသော IDD2 DNA ကို pB7RWG266 ထဲသို့ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ပြီး p35S:IDD2-RFP ကို ​​ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ pGID1b::2xmTQ2-GID1b ကိုထုတ်လုပ်ရန်အတွက် GID1b coding region ၏ အထက်ပိုင်းရှိ 3.9 kb fragment နှင့် GID1b cDNA (1.3 kb) နှင့် terminator (3.4 kb) ပါ၀င်သည့် 4.7 kb fragment ကို Supplementary Table 3 ရှိ primers များကို အသုံးပြု၍ ဦးစွာ amplify လုပ်ပြီးနောက် pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) နှင့် pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ထဲသို့ အသီးသီးထည့်သွင်းခဲ့ပြီး နောက်ဆုံးတွင် Gateway cloning ကို အသုံးပြု၍ pDONR221 2xmTQ268 နှင့် pGreen 012567 target vector ထဲသို့ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ pCUC2::LSSmOrange ကိုထုတ်လုပ်ရန်အတွက်၊ CUC2 promoter sequence (ATG ၏အထက်ပိုင်း 3229 bp) နောက်တွင် N7 nuclear localization signal နှင့် NOS transcriptional terminator ပါရှိသော large Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 ၏ coding sequence ကို Gateway 3-fragment recombination system (Invitrogen) ကို အသုံးပြု၍ pGreen kanamycin targeting vector ထဲသို့ စုစည်းခဲ့သည်။ plant binary vector ကို Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ထဲသို့ထည့်သွင်းပြီး Nicotiana benthamiana အရွက်များထဲသို့ Agrobacterium infiltration နည်းလမ်းဖြင့် နှင့် Arabidopsis thaliana Col-0 ထဲသို့ floral dip နည်းလမ်းဖြင့် အသီးသီးထည့်သွင်းခဲ့သည်။ pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry နှင့် pCLV3::mCherry-NLS qmRGA တို့ကို သက်ဆိုင်ရာ cross များ၏ F3 နှင့် F1 progenies များမှ အသီးသီးခွဲထုတ်ခဲ့သည်။
RNA in situ hybridization ကို ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 1 cm ရှည်သော အညွန့်ထိပ်ဖျားများ72 တွင် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး၊ ၎င်းတို့ကို စုဆောင်းကာ 4°C အထိ ကြိုတင်အအေးခံထားသော FAA ပျော်ရည် (3.7% formaldehyde၊ 5% acetic acid၊ 50% ethanol) တွင် ချက်ချင်းပြုပြင်ခဲ့သည်။ 2 × 15 မိနစ် vacuum treatment ပြီးနောက်၊ fixative ကိုပြောင်းလဲပြီး နမူနာများကို တစ်ညလုံး incubation လုပ်ခဲ့သည်။ GID1a၊ GID1b၊ GID1c၊ GAI၊ RGL1၊ RGL2၊ နှင့် RGL3 cDNA များနှင့် antisense probe များကို ၎င်းတို့၏ 3′-UTR များသို့ Rosier et al.73 မှဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း Supplementary Table 3 တွင်ပြထားသည့် primers များကိုအသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ Digoxigenin-labeled probes များကို digoxigenin antibodies (3000-fold dilution; Roche, catalog number: 11 093 274 910) ကို အသုံးပြု၍ immunoimmuno ဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့ပြီး အပိုင်းများကို 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-fold dilution)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200-fold dilution) solution ဖြင့် ဆေးဆိုးခဲ့သည်။