ထင်းရှူးပင်၏ နီမတုတ်ရောဂါကို လှုံ့ဆော်ပေးသည့်အရာများအဖြစ် အိုင်အိုဒင်းနှင့် အဗာမက်တင်ကို အကဲဖြတ်ခြင်း

ထင်းရှူးနီမတုတ်သည် ထင်းရှူးတောဂေဟစနစ်များတွင် ပြင်းထန်သောစီးပွားရေးဆုံးရှုံးမှုများဖြစ်စေသည်ဟု လူသိများသော သီးခြားခွဲထားသည့် ရွှေ့ပြောင်းနေထိုင်သည့် endoparasite တစ်ခုဖြစ်သည်။ လက်ရှိလေ့လာမှုတွင် ထင်းရှူးနီမတုတ်များအပေါ် halogenated indoles များ၏ နီမတုတ်များအပေါ် လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ၎င်းတို့၏လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားကို ပြန်လည်သုံးသပ်ထားသည်။ ထင်းရှူးနီမတုတ်များအပေါ် 5-iodoindole နှင့် avermectin (အပြုသဘောဆောင်သောထိန်းချုပ်မှု) တို့၏ နီမတုတ်များအပေါ် လုပ်ဆောင်ချက်များသည် အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသောအခါတွင် အလားတူဖြစ်ပြီး မြင့်မားသည် (10 μg/mL)။ 5-iodoindole သည် မျိုးအောင်နိုင်စွမ်း၊ မျိုးပွားနိုင်စွမ်း၊ သန္ဓေသားနှင့် လောင်းသေဆုံးမှုနှင့် လမ်းလျှောက်မှုအပြုအမူတို့ကို လျော့ကျစေသည်။ ကျောရိုးမဲ့သတ္တဝါများတွင် သီးခြား glutamate-gated chloride channel receptors များနှင့် ligands များ၏ မော်လီကျူး အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများသည် avermectin ကဲ့သို့ပင် 5-iodoindole သည် receptor active site နှင့် တင်းကျပ်စွာ ချိတ်ဆက်သည်ဟူသော အယူအဆကို ထောက်ခံသည်။ 5-Iodoindole သည် နီမတုတ်များတွင် ပုံမှန်မဟုတ်သော ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါများ ပြိုကျခြင်း/ကျုံ့ခြင်းနှင့် vacuolization တိုးလာခြင်းအပါအဝင် phenotypic ပုံပျက်ခြင်းအမျိုးမျိုးကိုလည်း ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်။ ဤရလဒ်များသည် vacuoles များသည် nematode methylation ကြောင့် သေဆုံးခြင်းတွင် အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှ ပါဝင်နိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ အရေးကြီးသည်မှာ 5-iodoindole သည် အပင်မျိုးစိတ်နှစ်မျိုးလုံး (ဂေါ်ဖီထုပ်နှင့် မုန်လာဥနီ) အတွက် အဆိပ်မရှိပါ။ ထို့ကြောင့် ဤလေ့လာမှုက ပတ်ဝန်းကျင်အခြေအနေများတွင် iodoindole ကို အသုံးပြုခြင်းသည် ထင်းရှူးပင်ညှိုးနွမ်းမှုဒဏ်ရာကို ထိန်းချုပ်နိုင်ကြောင်း ပြသသည်။
ထင်းရှူးသစ်သား နီမတုတ် (Bursaphelenchus xylophilus) သည် ထင်းရှူးသစ်သား နီမတုတ် (PWN) တွင် ပါဝင်ပြီး ထင်းရှူးတောဂေဟစနစ်ကို ပြင်းထန်စွာ ပျက်စီးစေသည်ဟု လူသိများသည်။1 ထင်းရှူးသစ်သား နီမတုတ်ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ထင်းရှူးပင်ညှိုးရောဂါ (PWD) သည် အာရှနှင့် ဥရောပအပါအဝင် တိုက်ကြီးများစွာတွင် ပြင်းထန်သောပြဿနာတစ်ခု ဖြစ်လာနေပြီး မြောက်အမေရိကတွင် နီမတုတ်သည် မိတ်ဆက်ထားသော ထင်းရှူးမျိုးစိတ်များကို ဖျက်ဆီးသည်1,2။ ထင်းရှူးပင်ကျဆင်းမှုသည် အဓိကစီးပွားရေးပြဿနာတစ်ခုဖြစ်ပြီး ၎င်း၏ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာပျံ့နှံ့မှုအလားအလာသည် စိုးရိမ်စရာကောင်းသည်3။ အောက်ပါထင်းရှူးမျိုးစိတ်များသည် နီမတုတ်မှ အများဆုံးတိုက်ခိုက်ခံရသည်- Pinus densiflora၊ Pinus sylvestris၊ Pinus thunbergii၊ Pinus koraiensis၊ Pinus thunbergii၊ Pinus thunbergii နှင့် Pinus radiata4။ ထင်းရှူးပင်များ ကူးစက်ခံရပြီး ရက်သတ္တပတ်များ သို့မဟုတ် လများအတွင်း သေစေနိုင်သော ပြင်းထန်သောရောဂါတစ်ခုဖြစ်သည်။ ထို့အပြင် ထင်းရှူးပင်များ ကူးစက်မှုများသည် ဂေဟစနစ်အမျိုးမျိုးတွင် အဖြစ်များသောကြောင့် ရောဂါကူးစက်မှုကွင်းဆက်များကို ထူထောင်ထားသည်1။
Bursaphelenchus xylophilus သည် superfamily Aphelenchoidea နှင့် clade 102.5 တွင်ပါဝင်သော သီးခြားခွဲထားသည့် အပင်ကပ်ပါးပိုး နီမတုတ်ဖြစ်သည်။ နီမတုတ်သည် မှိုများကို စားသုံးပြီး ထင်းရှူးပင်များ၏ သစ်သားတစ်ရှူးများတွင် မျိုးပွားကာ ပိုးလောင်းအဆင့်လေးဆင့်ဖြစ်သည့် L1၊ L2၊ L3၊ L4 နှင့် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ အကောင်1,6 အဖြစ် တိုးတက်ပြောင်းလဲလာသည်။ အစာရှားပါးမှုအခြေအနေများတွင် ထင်းရှူးနီမတုတ်သည် အထူးပိုးလောင်းအဆင့် - dauer သို့ ကူးပြောင်းသွားပြီး ၎င်း၏ သယ်ဆောင်သူ - ထင်းရှူးခေါက်ပိုး (Monochamus alternatus) ကို ကပ်ပါးပိုးအဖြစ် သယ်ဆောင်ကာ ကျန်းမာသော ထင်းရှူးပင်များထံ လွှဲပြောင်းပေးသည်။ ကျန်းမာသော အိမ်ရှင်များတွင် နီမတုတ်များသည် အပင်တစ်ရှူးများမှတစ်ဆင့် လျင်မြန်စွာ ရွှေ့ပြောင်းပြီး parenchymatous ဆဲလ်များကို စားသုံးကာ ၎င်းသည် ဓာတ်မတည့်မှုတုံ့ပြန်မှုများစွာ၊ ထင်းရှူးညှိုးနွမ်းခြင်းနှင့် ရောဂါကူးစက်ခံရပြီး တစ်နှစ်အတွင်း သေဆုံးခြင်းတို့ကို ဖြစ်စေသည်1,7,8။
ထင်းရှူးနီမတုတ်များကို ဇီဝဗေဒအရ ထိန်းချုပ်ခြင်းသည် စိန်ခေါ်မှုတစ်ရပ်ဖြစ်ပြီး ၂၀ ရာစုကတည်းက ကွာရန်တင်းအစီအမံများ ရှိခဲ့သည်။ ထင်းရှူးနီမတုတ်များကို ထိန်းချုပ်ရန် လက်ရှိဗျူဟာများတွင် အဓိကအားဖြင့် သစ်သားမှိုသတ်ခြင်းနှင့် သစ်ပင်ပင်စည်များထဲသို့ နီမတုတ်များ ထည့်သွင်းခြင်းအပါအဝင် ဓာတုကုသမှုများ ပါဝင်သည်။ အသုံးအများဆုံး နီမတုတ်ဆေးများမှာ avermectin မိသားစုဝင် avermectin နှင့် avermectin benzoate တို့ဖြစ်သည်။ ဤစျေးကြီးသော ဓာတုပစ္စည်းများသည် နီမတုတ်မျိုးစိတ်များစွာကို အလွန်ထိရောက်စွာ တိုက်ဖျက်နိုင်ပြီး ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသည်။ သို့သော် ဤနီမတုတ်ဆေးများကို ထပ်ခါတလဲလဲ အသုံးပြုခြင်းသည် ခံနိုင်ရည်ရှိသော ထင်းရှူးနီမတုတ်များ ပေါ်ပေါက်လာစေရန် ရွေးချယ်မှုဖိအားကို ဖန်တီးပေးလိမ့်မည်ဟု မျှော်လင့်ရပြီး Leptinotarsa ​​​​decemlineata၊ Plutella xylostella နှင့် Trichostrongylus colubriformis နှင့် Ostertagia circumcincta ကဲ့သို့သော အင်းဆက်ပိုးမွှားများစွာအတွက် ပြသထားသည့်အတိုင်း ခံနိုင်ရည်ရှိသော ထင်းရှူးနီမတုတ်များ ပေါ်ပေါက်လာစေရန် သေချာပေါက် ဦးတည်စေမည့် ရွေးချယ်မှုဖိအားကို ဖန်တီးပေးလိမ့်မည်ဟု မျှော်လင့်ရပြီး ၎င်းတို့သည် avermectins10,11,12 ကို တဖြည်းဖြည်း ခံနိုင်ရည်ရှိလာကြသည်။ ထို့ကြောင့် PVD ကို ထိန်းချုပ်ရန် အခြားရွေးချယ်စရာ၊ ကုန်ကျစရိတ်သက်သာပြီး ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် သဟဇာတဖြစ်သော အစီအမံများကို ရှာဖွေရန် ခုခံမှုပုံစံများကို မှန်မှန်လေ့လာရန်နှင့် နီမတုတ်ဆေးများကို အဆက်မပြတ် စစ်ဆေးရန် လိုအပ်ပါသည်။ မကြာသေးမီဆယ်စုနှစ်များအတွင်း စာရေးဆရာအများအပြားက အပင်မှထုတ်ယူထားသော အဆီအနှစ်များ၊ အဆီအနှစ်များနှင့် ပျံ့လွင့်နိုင်သောပစ္စည်းများကို နီမတုတ်ထိန်းချုပ်ရေးအေးဂျင့်များအဖြစ် အသုံးပြုရန် အဆိုပြုခဲ့ကြသည်13,14,15,16။
Caenorhabditis elegans 17 တွင် ဆဲလ်အချင်းချင်းနှင့် နိုင်ငံအချင်းချင်း အချက်ပြမှု မော်လီကျူးတစ်ခုဖြစ်သည့် indole ၏ နီမာတစ်သတ်မတ်မတ် လုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်းကို မကြာသေးမီက ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြခဲ့ပါသည်။ Indole သည် မိုက်ခရိုဘိုင်ယယ်ဂေဟဗေဒတွင် ကျယ်ပြန့်သော ဆဲလ်အတွင်း အချက်ပြမှုတစ်ခုဖြစ်ပြီး မိုက်ခရိုဘိုင်ယယ် ဇီဝကမ္မဗေဒ၊ spore ဖွဲ့စည်းမှု၊ plasmid တည်ငြိမ်မှု၊ ဆေးယဉ်ပါးမှု၊ biofilm ဖွဲ့စည်းမှုနှင့် အဆိပ်သင့်မှုတို့ကို ထိခိုက်စေသော လုပ်ဆောင်ချက်များစွာကို ထိန်းချုပ်ပေးသည် 18၊ 19။ အခြားရောဂါဖြစ်စေသော နီမာတုတ်များအပေါ် indole နှင့် ၎င်း၏ဆင်းသက်လာမှုများ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို လေ့လာထားခြင်း မရှိသေးပါ။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ထင်းရှူးနီမာတုတ်များအပေါ် indoles ၃၄ ခု၏ နီမာတစ်သတ်မတ်မတ် လုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်းကို စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပြီး အဏုကြည့်မှန်ပြောင်း၊ time-lapse ဓာတ်ပုံနှင့် မော်လီကျူး docking စမ်းသပ်ချက်များကို အသုံးပြု၍ အစွမ်းထက်ဆုံး 5-iodoindole ၏ လုပ်ဆောင်မှုယန္တရားကို ရှင်းလင်းဖော်ပြခဲ့ပြီး မျိုးစေ့အပင်ပေါက်ခြင်း စမ်းသပ်ချက်ကို အသုံးပြု၍ အပင်များအပေါ် ၎င်း၏ အဆိပ်သင့်စေသော အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို အကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။
indole ပြင်းအားမြင့်မားခြင်း (>1.0 mM) သည် nematodes များအပေါ် nematiciscidal effect ရှိကြောင်း ယခင်က သတင်းပို့ထားပါသည်17။ B. xylophilus (ရောနှောဘဝအဆင့်များ) ကို indole သို့မဟုတ် 1 mM တွင် indole derivatives ၃၃ မျိုးဖြင့် ကုသပြီးနောက်၊ B. xylophilus ၏ သေဆုံးမှုကို ထိန်းချုပ်အုပ်စုနှင့် ကုသထားသောအုပ်စုများတွင် အသက်ရှင်သောနှင့် သေဆုံးသော nematodes များကို ရေတွက်ခြင်းဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။ indoles ငါးခုသည် သိသာထင်ရှားသော nematiciscidal activity ကို ပြသခဲ့သည်။ ကုသမှုမခံယူရသေးသော ထိန်းချုပ်အုပ်စု၏ ရှင်သန်နှုန်းမှာ ၂၄ နာရီအကြာတွင် 95 ± 7% ရှိသည်။ စမ်းသပ်ထားသော indoles ၃၄ ခုအနက် 1 mM တွင် 5-iodoindole နှင့် 4-fluoroindole တို့သည် 100% သေဆုံးစေပြီး 5,6-difluoroindigo၊ methylindole-7-carboxylate နှင့် 7-iodoindole တို့သည် သေဆုံးမှုနှုန်း 50% ခန့် ဖြစ်စေသည် (ဇယား ၁)။
ထင်းရှူးသစ်သား နီမတုတ်၏ vacuole ဖွဲ့စည်းမှုနှင့် ဇီဝြဖစ်ပျက်မှုအပေါ် 5-iodoindole ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှု။ (A) avermectin နှင့် 5-iodoindole ၏ အရွယ်ရောက်ပြီးသော အထီး နီမတုတ်များအပေါ် အကျိုးသက်ရောက်မှု၊ (B) L1 အဆင့် နီမတုတ်ဥများနှင့် (C) B. xylophilus ၏ ဇီဝြဖစ်ပျက်မှု၊ (i) vacuole များကို 0 နာရီတွင် မတွေ့ရှိရပါ၊ ကုသမှုကြောင့် (ii) vacuole များ၊ (iii) vacuole အများအပြား စုပုံခြင်း၊ (iv) vacuole များ ရောင်ရမ်းခြင်း၊ (v) vacuole များ ပေါင်းစည်းခြင်းနှင့် (vi) ဧရာမ vacuole များ ဖွဲ့စည်းခြင်းတို့ ဖြစ်ပေါ်လာခဲ့သည်။ အနီရောင်မြားများသည် vacuole များ ရောင်ရမ်းခြင်းကို ညွှန်ပြပြီး အပြာရောင်မြားများသည် vacuole များ ပေါင်းစည်းခြင်းကို ညွှန်ပြပြီး အနက်ရောင်မြားများသည် ဧရာမ vacuole များကို ညွှန်ပြသည်။ စကေးဘား = 50 μm။
ထို့အပြင်၊ ဤလေ့လာမှုသည် ထင်းရှူးနီမတုတ်များတွင် မီသိန်းကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော သေဆုံးခြင်း၏ အစဉ်လိုက်ဖြစ်စဉ်ကိုလည်း ဖော်ပြခဲ့သည် (ပုံ ၄ဂ)။ မီသိန်းကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော သေဆုံးခြင်းသည် ထင်ရှားသော ဆိုက်တိုပလာစမစ် ဗာကျူအိုးလ်များ27 စုပုံခြင်းနှင့်ဆက်စပ်နေသော အသေခံမဟုတ်သော ဆဲလ်သေဆုံးမှုအမျိုးအစားတစ်ခုဖြစ်သည်။ ထင်းရှူးနီမတုတ်များတွင်တွေ့ရှိရသော morphological ချို့ယွင်းချက်များသည် မီသိန်းကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော သေဆုံးခြင်းယန္တရားနှင့် အနီးကပ်ဆက်စပ်နေပုံရသည်။ အချိန်အမျိုးမျိုးတွင် အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းဖြင့် စစ်ဆေးခြင်းအရ 5-iodoindole (0.1 mM) နှင့် ၂၀ နာရီကြာထိတွေ့ပြီးနောက် ဧရာမဗာကျူအိုးလ်များ ဖြစ်ပေါ်လာကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းဖြင့် ကုသမှု ၈ နာရီကြာပြီးနောက် ဗာကျူအိုးလ်များကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ၎င်းတို့၏အရေအတွက်သည် ၁၂ နာရီအကြာတွင် တိုးလာခဲ့သည်။ ၁၄ နာရီအကြာတွင် ကြီးမားသော ဗာကျူအိုးလ်များစွာကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ကုသမှု ၁၂-၁၆ နာရီအကြာတွင် ပေါင်းစပ်ထားသော ဗာကျူအိုးလ်များစွာကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်းမြင်နိုင်ပြီး ဗာကျူအိုးလ်ပေါင်းစပ်မှုသည် မီသိန်းကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော သေဆုံးခြင်းယန္တရား၏ အခြေခံဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ၂၀ နာရီကြာပြီးနောက် တီကောင်တစ်လျှောက်တွင် ဧရာမဗာကျူအိုးလ်များစွာကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဤလေ့လာတွေ့ရှိချက်များသည် C. elegans တွင် metuosis ၏ ပထမဆုံးအစီရင်ခံစာကို ကိုယ်စားပြုသည်။
5-iodoindole ကုသထားသော တီကောင်များတွင် vacuole စုစည်းမှုနှင့် ကွဲအက်မှုကိုလည်း တွေ့ရှိရသည် (ပုံ ၅)၊ တီကောင်ကွေးခြင်းနှင့် ပတ်ဝန်းကျင်သို့ vacuole ထုတ်လွှတ်မှုတို့က သက်သေပြနေသည်။ ကြက်ဥခွံအမြှေးပါးတွင်လည်း Vacuole ပျက်ယွင်းမှုကို တွေ့ရှိရပြီး ဥဥချိန်တွင် L2 မှ ပုံမှန်အားဖြင့် မပျက်စီးအောင် ထိန်းသိမ်းထားသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ S2)။ ဤလေ့လာတွေ့ရှိချက်များသည် vacuole ဖွဲ့စည်းခြင်းနှင့် suppuration လုပ်ငန်းစဉ်တွင် အရည်စုဆောင်းခြင်းနှင့် osmoregulatory ပျက်ကွက်ခြင်းအပြင် reversible cell injury (RCI) ပါဝင်ပတ်သက်မှုကို ထောက်ခံသည် (ပုံ ၅)။
တွေ့ရှိရသည့် vacuole ဖွဲ့စည်းမှုတွင် အိုင်အိုဒင်း၏ အခန်းကဏ္ဍကို ယူဆချက်ထုတ်ကာ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆိုဒီယမ် အိုင်အိုဒိုက် (NaI) နှင့် ပိုတက်စီယမ် အိုင်အိုဒိုက် (KI) တို့၏ nematicidal activity ကို စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ သို့သော်၊ ပြင်းအားများ (0.1၊ 0.5 သို့မဟုတ် 1 mM) တွင်၊ ၎င်းတို့သည် nematode ရှင်သန်မှု သို့မဟုတ် vacuole ဖွဲ့စည်းမှုကို မထိခိုက်ခဲ့ပါ (နောက်ဆက်တွဲပုံ S5)၊ သို့သော် 1 mM KI တွင် nematicidal အာနိသင် အနည်းငယ်ရှိခဲ့သည်။ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ 5-iodoindole ကဲ့သို့ပင် 7-iodoindole (1 သို့မဟုတ် 2 mM) သည် vacuole များစွာနှင့် ဖွဲ့စည်းပုံပုံပျက်မှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ S6)။ iodoindoles နှစ်ခုသည် ထင်းရှူး nematodes တွင် အလားတူ phenotypic ဝိသေသလက္ခဏာများကို ပြသခဲ့ပြီး NaI နှင့် KI တွင် မပြသခဲ့ပါ။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ စမ်းသပ်ထားသော ပြင်းအားများတွင် indole သည် B. xylophilus တွင် vacuole ဖွဲ့စည်းမှုကို မဖြစ်ပေါ်စေခဲ့ပါ (ဒေတာမပြထားပါ)။ ထို့ကြောင့်၊ ရလဒ်များက indole-iodine complex သည် B. xylophilus ၏ vacuolization နှင့် metabolism အတွက် တာဝန်ရှိကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။
nematicidal activity အတွက် စမ်းသပ်ထားသော indoles များထဲတွင် 5-iodoindole သည် -5.89 kcal/mol အမြင့်ဆုံး slip index ရှိပြီး 7-iodoindole (-4.48 kcal/mol)၊ 4-fluoroindole (-4.33) နှင့် indole (-4.03) တို့ အသီးသီးရှိပါသည် (ပုံ ၆)။ 5-iodoindole နှင့် leucine 218 တို့၏ ခိုင်မာသော backbone hydrogen bonding သည် ၎င်း၏ binding ကို တည်ငြိမ်စေသော်လည်း၊ အခြား indole derivatives အားလုံးသည် side chain hydrogen bonds များမှတစ်ဆင့် serine 260 နှင့် bind လုပ်ပါသည်။ အခြားပုံစံပြုလုပ်ထားသော iodoindoles များထဲတွင် 2-iodoindole သည် -5.248 kcal/mol ၏ ချည်နှောင်တန်ဖိုးရှိပြီး၊ ၎င်းသည် leucine 218 နှင့် ၎င်း၏ အဓိက ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးကြောင့်ဖြစ်သည်။ အခြားလူသိများသော ချည်နှောင်မှုများတွင် 3-iodoindole (-4.3 kcal/mol)၊ 4-iodoindole (-4.0 kcal/mol) နှင့် 6-fluoroindole (-2.6 kcal/mol) တို့ ပါဝင်သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ S8)။ 5-iodoindole နှင့် 2-iodoindole မှလွဲ၍ halogenated indoles အများစုနှင့် indole ကိုယ်တိုင်သည် serine 260 နှင့် bond တစ်ခုဖွဲ့စည်းသည်။ ivermectin (Supplementary Fig. S7) တွင်တွေ့ရှိရသည့်အတိုင်း leucine 218 နှင့် hydrogen bonding သည် receptor-ligand binding ကိုထိရောက်စွာညွှန်ပြနေသည်ဟူသောအချက်က 5-iodoindole နှင့် 2-iodoindole တို့သည် ivermectin ကဲ့သို့ပင် leucine 218 မှတစ်ဆင့် GluCL receptor ၏ active site နှင့် တင်းကျပ်စွာချည်နှောင်ကြောင်း အတည်ပြုသည် (Fig. 6 နှင့် Supplementary Fig. S8)။ ဤချည်နှောင်မှုသည် GluCL complex ၏ open pore structure ကိုထိန်းသိမ်းရန်နှင့် GluCL receptor၊ 5-iodoindole၊ 2-iodoindole၊ avermectin နှင့် ivermectin တို့၏ active site နှင့် တင်းကျပ်စွာချည်နှောင်ခြင်းဖြင့် ion channel ကိုဖွင့်ထားပြီး အရည်စုပ်ယူမှုကိုခွင့်ပြုရန် လိုအပ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့အဆိုပြုပါသည်။
indole နှင့် halogenated indole တို့၏ GluCL သို့ မော်လီကျူး ချိတ်ဆက်ခြင်း။ (A) indole၊ (B) 4-fluoroindole၊ (C) 7-iodoindole နှင့် (D) 5-iodoindole ligands များ၏ GluCL ၏ active site သို့ ချည်နှောင်ခြင်း orientations။ ပရိုတင်းကို ဖဲကြိုးဖြင့် ကိုယ်စားပြုပြီး backbone hydrogen bonds များကို အဝါရောင် အစက်ချမျဉ်းများအဖြစ် ပြသထားသည်။ (A′), (B′), (C′), နှင့် (D′) သည် သက်ဆိုင်ရာ ligands များ၏ ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ amino acid အကြွင်းအကျန်များနှင့် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများကို ပြသပြီး side-chain hydrogen bonds များကို ပန်းရောင် အစက်ချမြားများဖြင့် ညွှန်ပြသည်။
ဂေါ်ဖီထုပ်နှင့် မုန်လာဥနီမျိုးစေ့များ အပင်ပေါက်ခြင်းအပေါ် 5-iodoindole ၏ အဆိပ်သင့်စေသော အာနိသင်ကို အကဲဖြတ်ရန် စမ်းသပ်ချက်များ ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ 5-iodoindole (0.05 သို့မဟုတ် 0.1 mM) သို့မဟုတ် avermectin (10 μg/mL) သည် ကနဦးအပင်ပေါက်ခြင်းနှင့် အပင်ပေါက်ပေါက်ခြင်းအပေါ် အနည်းငယ်သာ သက်ရောက်မှုရှိသည် သို့မဟုတ် လုံးဝမရှိပါ (ပုံ ၇)။ ထို့အပြင်၊ ကုသမှုမခံယူရသေးသော ထိန်းချုပ်မျိုးစေ့များနှင့် 5-iodoindole သို့မဟုတ် avermectin ဖြင့် ကုသထားသော မျိုးစေ့များအကြားတွင် သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက် မတွေ့ရှိရပါ။ 5-iodoindole ၏ 1 mM (၎င်း၏တက်ကြွသော ပါဝင်မှု၏ ၁၀ ဆ) သည် ဘေးတိုက်အမြစ်များ ဖွံ့ဖြိုးမှုကို အနည်းငယ် နှောင့်နှေးစေသော်လည်း၊ taproot ရှည်ထွက်ခြင်းနှင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ဘေးတိုက်အမြစ်အရေအတွက်အပေါ် အကျိုးသက်ရောက်မှုသည် အရေးမကြီးပါ။ ဤရလဒ်များသည် 5-iodoindole သည် အပင်ဆဲလ်များအတွက် အဆိပ်မရှိပြီး လေ့လာထားသော ပါဝင်မှုများတွင် အပင်ဖွံ့ဖြိုးမှုလုပ်ငန်းစဉ်များကို အနှောင့်အယှက်မဖြစ်စေကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။
5-iodoindole ၏ မျိုးစေ့အပင်ပေါက်ခြင်းအပေါ် အကျိုးသက်ရောက်မှု။ avermectin သို့မဟုတ် 5-iodoindole ပါဝင်သော သို့မဟုတ် မပါဘဲ Murashige နှင့် Skoog agar medium ပေါ်တွင် B. oleracea နှင့် R. raphanistrum မျိုးစေ့များ၏ အပင်ပေါက်ခြင်း၊ အပင်ပေါက်ခြင်းနှင့် ဘေးတိုက်အမြစ်တွယ်ခြင်း။ ၂၂°C တွင် ၃ ရက်ကြာ ပျိုးထောင်ပြီးနောက် အပင်ပေါက်ခြင်းကို မှတ်တမ်းတင်ထားသည်။
ဤလေ့လာမှုတွင် အင်ဒိုးလ်များကြောင့် နီမတုတ်သေဆုံးခြင်း ဖြစ်ရပ်များစွာကို ဖော်ပြထားသည်။ အရေးကြီးသည်မှာ၊ ဤသည်မှာ ထင်းရှူးပင်အပ်များတွင် iodoindole မှ မီသိုင်းလေးရှင်း (အမြှေးပါးကြီးများ တဖြည်းဖြည်း ပေါင်းစပ်သွားပြီး နောက်ဆုံးတွင် အမြှေးပါးကွဲအက်ခြင်းနှင့် သေဆုံးခြင်းသို့ ဦးတည်စေသော သေးငယ်သည့် အလွှာများ စုပုံလာခြင်းကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော လုပ်ငန်းစဉ်) ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည့် ပထမဆုံး အစီရင်ခံစာဖြစ်ပြီး၊ iodoindole သည် စီးပွားဖြစ် nematicide avermectin နှင့်ဆင်တူသော သိသာထင်ရှားသော နီမတုတ်သေစေနိုင်သော ဂုဏ်သတ္တိများကို ပြသသည်။
အင်ဒိုးလ်များသည် prokaryotes နှင့် eukaryotes များတွင် biofilm inhibition/formation၊ ဘက်တီးရီးယားရှင်သန်မှုနှင့် pathogenicity အပါအဝင် အချက်ပြမှုလုပ်ဆောင်ချက်များစွာကို လုပ်ဆောင်ကြောင်း ယခင်က သတင်းပို့ခဲ့ဖူးသည်19,32,33,34။ မကြာသေးမီက halogenated indoles၊ indole alkaloids နှင့် semisynthetic indole derivatives များ၏ အလားအလာရှိသော ကုထုံးဆိုင်ရာအကျိုးသက်ရောက်မှုများသည် ကျယ်ပြန့်သော သုတေသနစိတ်ဝင်စားမှုကို ဆွဲဆောင်ခဲ့သည်35,36,37။ ဥပမာအားဖြင့်၊ halogenated indoles များသည် ရေရှည်တည်တံ့သော Escherichia coli နှင့် Staphylococcus aureus ဆဲလ်များကို သတ်ပစ်နိုင်ကြောင်း ပြသထားသည်37။ ထို့အပြင်၊ အခြားမျိုးစိတ်များ၊ မျိုးစုများနှင့် နိုင်ငံများအပေါ် halogenated indoles ၏ အာနိသင်ကို လေ့လာခြင်းသည် သိပ္ပံနည်းကျစိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းပြီး ဤလေ့လာမှုသည် ဤရည်မှန်းချက်ပန်းတိုင်သို့ ရောက်ရှိရန် ခြေလှမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။
ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် C. elegans များတွင် 5-iodoindole ကြောင့်ဖြစ်သော lethality အတွက် ယန္တရားတစ်ခုကို အဆိုပြုပါသည် (ပုံ 4C နှင့် 5)။ ရောင်ရမ်းခြင်းနှင့် vacuolar degeneration ကဲ့သို့သော edematous ပြောင်းလဲမှုများသည် RCI နှင့် methylation ၏ ညွှန်ပြချက်များဖြစ်ပြီး cytoplasm တွင် giant vacuoles48,49 အဖြစ်ထင်ရှားသည်။ RCI သည် ATP ထုတ်လုပ်မှုကို လျှော့ချခြင်း၊ ATPase pump ပျက်ကွက်ခြင်း သို့မဟုတ် ဆဲလ်အမြှေးပါးများကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေခြင်းနှင့် Na+၊ Ca2+ နှင့် ရေ 50,51,52 လျင်မြန်စွာဝင်ရောက်လာခြင်းဖြင့် စွမ်းအင်ထုတ်လုပ်မှုကို အနှောင့်အယှက်ပေးသည်။ Ca2+ နှင့် ရေ 53 ဝင်ရောက်လာခြင်းကြောင့် cytoplasm တွင် အရည်များစုပုံလာခြင်းကြောင့် တိရစ္ဆာန်ဆဲလ်များတွင် Intracytoplasmic vacuoles များ ပေါ်ပေါက်လာသည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက ပျက်စီးမှုဟာ ယာယီဖြစ်ပြီး ဆဲလ်တွေက အချိန်အတိုင်းအတာတစ်ခုအထိ ATP ထုတ်လုပ်ဖို့ စတင်လုပ်ဆောင်ရင် ဆဲလ်ပျက်စီးမှုရဲ့ ဒီယန္တရားကို ပြောင်းပြန်လှန်နိုင်ပါတယ်၊ ဒါပေမယ့် ပျက်စီးမှုက ဆက်ရှိနေရင် ဒါမှမဟုတ် ပိုဆိုးလာရင် ဆဲလ်တွေ သေဆုံးပါတယ်။54 ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ လေ့လာတွေ့ရှိချက်တွေအရ 5-iodoindole နဲ့ ကုသထားတဲ့ nematodes တွေဟာ ဖိစီးမှုအခြေအနေတွေနဲ့ ထိတွေ့ပြီးနောက် ပုံမှန်ဇီဝပေါင်းစပ်မှုကို ပြန်လည်ရရှိနိုင်မှာ မဟုတ်ပါဘူး။
B. xylophilus တွင် 5-iodoindole မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော methylation phenotype သည် iodine ရှိနေခြင်းနှင့် ၎င်း၏ မော်လီကျူး ဖြန့်ဖြူးမှုကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် 7-iodoindole သည် 5-iodoindole ထက် B. xylophilus အပေါ် အဟန့်အတားဖြစ်စေသော အာနိသင် နည်းပါးသောကြောင့်ဖြစ်သည် (ဇယား ၁ နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ S6)။ ဤရလဒ်များသည် Maltese et al. (၂၀၁၄) ၏ လေ့လာမှုများနှင့် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ကိုက်ညီပါသည်၊ ၎င်းတို့က para- မှ meta-position သို့ indole ရှိ pyridyl nitrogen moiety ၏ translocation သည် U251 ဆဲလ်များတွင် vacuolization၊ growth inhibition နှင့် cytotoxicity တို့ကို ဖျက်သိမ်းလိုက်သည်ဟု ဖော်ပြခဲ့ပြီး ပရိုတင်းရှိ သီးခြား active site နှင့် မော်လီကျူး၏ အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုသည် အလွန်အရေးကြီးကြောင်း အကြံပြုထားသည်27,44,45။ ဤလေ့လာမှုတွင် တွေ့ရှိရသည့် indole သို့မဟုတ် halogenated indoles နှင့် GluCL receptors များအကြား အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုသည်လည်း ဤအယူအဆကို ထောက်ခံသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် 5- နှင့် 2-iodoindole သည် စစ်ဆေးထားသော အခြား indoles များထက် GluCL receptors များနှင့် ပိုမိုအားကောင်းစွာ ချိတ်ဆက်ကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သောကြောင့်ဖြစ်သည် (ပုံ ၆ နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ S8)။ အင်ဒိုးလ်၏ ဒုတိယ သို့မဟုတ် ပဉ္စမနေရာတွင်ရှိသော အိုင်အိုဒင်းသည် GluCL receptor ၏ leucine 218 နှင့် backbone hydrogen bonds များမှတစ်ဆင့် ချိတ်ဆက်ကြောင်း တွေ့ရှိရပြီး၊ အခြား halogenated indoles များနှင့် အင်ဒိုးလ်ကိုယ်တိုင်က serine 260 နှင့်အတူ အားနည်းသော side-chain hydrogen bonds များကို ဖွဲ့စည်းသည် (ပုံ ၆)။ ထို့ကြောင့် halogen ၏ localization သည် vacuolar degeneration ဖြစ်ပေါ်ခြင်းတွင် အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ကြောင်း၊ 5-iodoindole ၏ တင်းကျပ်စွာ ချိတ်ဆက်မှုသည် ion channel ကို ဖွင့်ထားပေးပြီး အရည်များ လျင်မြန်စွာ စီးဝင်လာခြင်းနှင့် vacuole ကွဲအက်ခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။ သို့သော် 5-iodoindole ၏ အသေးစိတ်လုပ်ဆောင်ချက် ယန္တရားကို ဆုံးဖြတ်ရန် ကျန်ရှိနေသေးသည်။
5-iodoindole ကို လက်တွေ့အသုံးမပြုမီ၊ အပင်များအပေါ် ၎င်း၏ အဆိပ်သင့်စေသော အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသင့်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ မျိုးစေ့အပင်ပေါက်ခြင်း စမ်းသပ်ချက်များအရ 5-iodoindole သည် လေ့လာထားသော ပြင်းအားများတွင် မျိုးစေ့အပင်ပေါက်ခြင်း သို့မဟုတ် နောက်ဆက်တွဲ ဖွံ့ဖြိုးမှုလုပ်ငန်းစဉ်များအပေါ် အပျက်သဘောဆောင်သော အကျိုးသက်ရောက်မှု မရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ ၇)။ ထို့ကြောင့်၊ ဤလေ့လာမှုသည် ထင်းရှူးပင်များအပေါ် ထင်းရှူးနီမတုတ်များ၏ အန္တရာယ်ကို ထိန်းချုပ်ရန် ဂေဟဗေဒပတ်ဝန်းကျင်တွင် 5-iodoindole အသုံးပြုမှုအတွက် အခြေခံအုတ်မြစ်ကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။
ယခင်အစီရင်ခံစာများအရ အင်ဒိုလ်အခြေခံကုထုံးသည် ပဋိဇီဝဆေးယဉ်ပါးမှုနှင့် ကင်ဆာဖြစ်ပွားမှုပြဿနာကို ဖြေရှင်းရန် အလားအလာရှိသောချဉ်းကပ်မှုတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်55။ ထို့အပြင်၊ အင်ဒိုလ်များတွင် ပဋိဇီဝဆေး၊ ကင်ဆာဆန့်ကျင်ရေး၊ အင်တီအောက်ဆီးဒင့်၊ ရောင်ရမ်းမှုကို ဆန့်ကျင်ရေး၊ ဆီးချိုရောဂါဆန့်ကျင်ရေး၊ ဗိုင်းရပ်စ်ပိုးသတ်ဆေး၊ ပွားများမှုကို ဆန့်ကျင်ရေးနှင့် တီဘီရောဂါတိုက်ဖျက်ရေး ဂုဏ်သတ္တိများရှိပြီး ဆေးဝါးဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွက် မျှော်လင့်ချက်ကောင်းသော အခြေခံအဖြစ် ဆောင်ရွက်နိုင်သည်56,57။ ဤလေ့လာမှုသည် အိုင်အိုဒင်းကို ကပ်ပါးကောင်ဆန့်ကျင်ရေးနှင့် သန်ချဆေးအဖြစ် အလားအလာရှိသောအသုံးပြုမှုကို ပထမဆုံးအကြိမ်အဖြစ် အကြံပြုထားသည်။
Avermectin ကို လွန်ခဲ့သော သုံးဆယ်နှစ်က ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပြီး ၂၀၁၅ ခုနှစ်တွင် နိုဘယ်ဆု ရရှိခဲ့ပြီး သန်ချဆေးအဖြစ် အသုံးပြုမှုသည် ယနေ့တိုင် တက်ကြွစွာ လုပ်ဆောင်နေဆဲဖြစ်သည်။ သို့သော် နီမတုတ်များနှင့် အင်းဆက်ပိုးမွှားများတွင် avermectins ကို ခံနိုင်ရည်ရှိမှု လျင်မြန်စွာ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်လာခြင်းကြောင့် ထင်းရှူးပင်များတွင် PWN ကူးစက်မှုကို ထိန်းချုပ်ရန် အခြားရွေးချယ်စရာ၊ ကုန်ကျစရိတ်နည်းပြီး ပတ်ဝန်းကျင်နှင့် သဟဇာတဖြစ်သော ဗျူဟာတစ်ခု လိုအပ်ပါသည်။ ဤလေ့လာမှုတွင် 5-iodoindole သည် ထင်းရှူးနီမတုတ်များကို မည်သို့သေစေသည်နှင့် 5-iodoindole သည် အပင်ဆဲလ်များအပေါ် အဆိပ်သင့်မှု နည်းပါးကြောင်းကိုလည်း ဖော်ပြထားပြီး၊ ၎င်းသည် ၎င်း၏ အနာဂတ် စီးပွားဖြစ်အသုံးချမှုအတွက် အလားအလာကောင်းများ ဖွင့်လှစ်ပေးပါသည်။
စမ်းသပ်ချက်အားလုံးကို ကိုရီးယားနိုင်ငံ၊ ဂျောင်ဆန်မြို့ရှိ ယုန်နမ်တက္ကသိုလ်၏ ကျင့်ဝတ်ကော်မတီမှ အတည်ပြုခဲ့ပြီး နည်းလမ်းများကို ယုန်နမ်တက္ကသိုလ်၏ ကျင့်ဝတ်ကော်မတီ၏ လမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
ဥပေါက်ဖွားခြင်း စမ်းသပ်ချက်များကို သတ်မှတ်ထားသော လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်43။ ဥပေါက်နှုန်း (HR) ကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက်၊ ၁ ရက်သား အရွယ်ရောက်ပြီးသော နီမတုတ်များ (အမ ၁၀၀ ခန့်နှင့် အထီး ၁၀၀ ခန့်) ကို မှိုပါရှိသော Petri ပန်းကန်များထဲသို့ လွှဲပြောင်းပေးပြီး ၂၄ နာရီကြာ ကြီးထွားစေခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဥများကို ခွဲထုတ်ပြီး ပိုးသတ်ထားသောရေတွင် 5-iodoindole (0.05 mM နှင့် 0.1 mM) သို့မဟုတ် avermectin (10 μg/ml) ဖြင့် ဆိုင်းငံ့ရည်အဖြစ် ကုသပေးခဲ့သည်။ ဤဆိုင်းငံ့ရည်များ (500 μl; ဥ ၁၀၀ ခန့်) ကို ၂၄-well တစ်ရှူးယဉ်ကျေးမှုပန်းကန်၏ အပေါက်များထဲသို့ လွှဲပြောင်းပြီး 22°C တွင် ပေါက်ဖွားစေခဲ့သည်။ L2 ရေတွက်မှုများကို ၂၄ နာရီ ပေါက်ဖွားပြီးနောက် ပြုလုပ်ခဲ့သော်လည်း ကောင်းမွန်သော ပလက်တီနမ်ဝါယာကြိုးဖြင့် လှုံ့ဆော်သောအခါ ဆဲလ်များ မရွေ့လျားပါက သေဆုံးသည်ဟု ယူဆခဲ့သည်။ ဤစမ်းသပ်ချက်ကို အဆင့်နှစ်ဆင့်ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး တစ်ကြိမ်လျှင် ခြောက်ကြိမ် ကြိမ်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ စမ်းသပ်ချက်နှစ်ခုလုံးမှ အချက်အလက်များကို ပေါင်းစပ်ပြီး တင်ပြခဲ့သည်။ HR ရာခိုင်နှုန်းကို အောက်ပါအတိုင်း တွက်ချက်သည်-
ယခင်တီထွင်ထားသော လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများကို အသုံးပြု၍ ပိုးလောင်းသေဆုံးမှုကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ နီမတုတ်ဥများကို စုဆောင်းပြီး သန္ဓေသားများကို ပိုးသတ်ထားသောရေတွင် ပေါင်းခံခြင်းဖြင့် ပေါက်ဖွားစေခြင်းဖြင့် L2 အဆင့် ပိုးလောင်းများထုတ်လုပ်သည်။ ပေါင်းခံထားသော ပိုးလောင်းများ (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် နီမတုတ် ၅၀၀) ကို 5-iodoindole (0.05 mM နှင့် 0.1 mM) သို့မဟုတ် avermectin (10 μg/ml) ဖြင့် ကုသပြီး B. cinerea Petri ပန်းကန်များတွင် မွေးမြူသည်။ ၂၂ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၄၈ နာရီကြာ ပြုစုပျိုးထောင်ပြီးနောက် နီမတုတ်များကို ပိုးသတ်ထားသောရေတွင် စုဆောင်းပြီး L2၊ L3 နှင့် L4 အဆင့်များ ရှိနေခြင်း ရှိမရှိ စစ်ဆေးသည်။ L3 နှင့် L4 အဆင့်များ ရှိနေခြင်းက ပိုးလောင်းအသွင်ပြောင်းမှုကို ညွှန်ပြပြီး L2 အဆင့် ရှိနေခြင်းက အသွင်ပြောင်းမှု မရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ရုပ်ပုံများကို iRiS™ Digital Cell Imaging System ကို အသုံးပြု၍ ရယူခဲ့သည်။ ဤစမ်းသပ်မှုကို အဆင့်နှစ်ဆင့်ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး၊ အဆင့်တစ်ခုစီတွင် ခြောက်ကြိမ် ထပ်ခါတလဲလဲ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ စမ်းသပ်မှုနှစ်ခုလုံးမှ အချက်အလက်များကို ပေါင်းစပ်ပြီး တင်ပြခဲ့သည်။
5-iodoindole နှင့် avermectin တို့၏ မျိုးစေ့များအပေါ် အဆိပ်သင့်မှုကို Murashige နှင့် Skoog agar ပြားများတွင် အပင်ပေါက်ခြင်းစမ်းသပ်မှုများကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။62 B. oleracea နှင့် R. raphanistrum မျိုးစေ့များကို ဦးစွာ ပိုးသတ်ထားသော ပေါင်းခံရေတွင် တစ်ရက်စိမ်ပြီး 100% အီသနော 1 ml ဖြင့်ဆေးကြောကာ 50% စီးပွားဖြစ် bleach (3% sodium hypochlorite) 1 ml ဖြင့် 15 မိနစ်ကြာ ပိုးသတ်ပြီး 1 ml ပိုးသတ်ထားသော ရေဖြင့် ငါးကြိမ်ဆေးကြောသည်။ ထို့နောက် ပိုးသတ်ထားသော မျိုးစေ့များကို 5-iodoindole သို့မဟုတ် avermectin ပါရှိသည်ဖြစ်စေ မပါရှိသည်ဖြစ်စေ 0.86 g/l (0.2X) Murashige နှင့် Skoog medium နှင့် 0.7% bacteriological agar ပါရှိသော အပင်ပေါက် agar ပြားများပေါ်တွင် ဖိကပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ပြားများကို 22°C တွင် ထားခဲ့ပြီး 3 ရက်ကြာ ပျိုးထောင်ပြီးနောက် ရုပ်ပုံများကို ရိုက်ယူခဲ့သည်။ ဤစမ်းသပ်မှုကို အဆင့်နှစ်ဆင့်ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး အဆင့်တစ်ခုစီတွင် ခြောက်ကြိမ်ထပ်ခါတလဲလဲ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။