Nature.com သို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုသည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်အသုံးပြုနေသော browser ဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးရလဒ်များအတွက် သင့် browser ၏ ဗားရှင်းအသစ်ကို အသုံးပြုရန် (သို့မဟုတ် Internet Explorer ရှိ Compatibility Mode ကို ပိတ်ရန်) အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထိုအတောအတွင်း၊ စဉ်ဆက်မပြတ် ပံ့ပိုးမှုရရှိစေရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆိုက်ကို styling သို့မဟုတ် JavaScript မပါဘဲ ပြသနေပါသည်။
သဘာဝထုတ်ကုန်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းနှင့် အကျိုးရှိစွာအသုံးပြုခြင်းသည် လူ့ဘဝကို တိုးတက်ကောင်းမွန်စေရန် ကူညီပေးနိုင်ပါသည်။ ပေါင်းပင်များကို ထိန်းချုပ်ရန်အတွက် အပင်ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားပေးသော ဓာတုပစ္စည်းများကို ပေါင်းသတ်ဆေးအဖြစ် တွင်ကျယ်စွာ အသုံးပြုကြသည်။ ပေါင်းသတ်ဆေးအမျိုးအစား အမျိုးမျိုးကို အသုံးပြုရန် လိုအပ်သောကြောင့်၊ လုပ်ဆောင်ချက် ယန္တရားအသစ်များပါရှိသော ဒြပ်ပေါင်းများကို ဖော်ထုတ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ Streptomyces werraensis MK493-CF1 မှ ထူးခြားသော N-alkoxypyrrole ဒြပ်ပေါင်း coumamonamide ကို ကျွန်ုပ်တို့ ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပြီး ပေါင်းစပ်မှုလုပ်ငန်းစဉ် အပြည့်အစုံကို တည်ထောင်ခဲ့သည်။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက် စမ်းသပ်မှုများမှတစ်ဆင့်၊ urs-monoamic acid သည် urs-monoamide ၏ ဓာတုဗေဒဆိုင်ရာ အလယ်အလတ်အဆင့်ဖြစ်ပြီး အလားအလာရှိသော...အပင်ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားပေးသောထို့အပြင်၊ HeLa ဆဲလ်များ၏ ကြီးထွားမှုကို ဆိုးကျိုးမသက်ရောက်ဘဲ ပေါင်းသတ်ဆေးအာနိသင်မြင့်မားသော urbenyloxy derivative (UDA) အပါအဝင် urbenonic acid derivatives အမျိုးမျိုးကို ကျွန်ုပ်တို့ တီထွင်ခဲ့ပါသည်။ urmotonic acid derivatives များသည် အပင် microtubules များကို နှောင့်ယှက်ကြောင်းလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ KAND သည် actin filaments များကို သက်ရောက်မှုရှိပြီး ဆဲလ်သေဆုံးမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ ဤဘက်စုံအကျိုးသက်ရောက်မှုများသည် လူသိများသော microtubule inhibitors များနှင့် ကွဲပြားပြီး ursonic acid အတွက် လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားအသစ်တစ်ခုကို အကြံပြုထားပြီး ၎င်းသည် ပေါင်းသတ်ဆေးအသစ်များ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုတွင် အရေးကြီးသော အားသာချက်တစ်ခုကို ကိုယ်စားပြုပါသည်။
အကျိုးပြု သဘာဝထုတ်ကုန်များနှင့် ၎င်းတို့၏ ဆင်းသက်လာသော ထုတ်ကုန်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းနှင့် လက်တွေ့အသုံးချခြင်းသည် လူ့ဘဝအရည်အသွေးကို မြှင့်တင်ရန် နည်းလမ်းတစ်ခုဖြစ်သည်။ အဏုဇီဝများ၊ အပင်များနှင့် အင်းဆက်ပိုးမွှားများမှ ထုတ်လုပ်သော ဒုတိယဇီဝဖြစ်စဉ်များသည် ဆေးပညာနှင့် စိုက်ပျိုးရေးတွင် အဓိကတိုးတက်မှုများကို ဦးတည်စေခဲ့သည်။ ပဋိဇီဝဆေးများနှင့် သွေးကင်ဆာရောဂါ တိုက်ဖျက်ဆေးများစွာကို သဘာဝထုတ်ကုန်များမှ တီထွင်ထုတ်လုပ်ခဲ့ကြသည်။ ထို့အပြင်၊ အမျိုးအစားအမျိုးမျိုးပိုးသတ်ဆေးများမှိုသတ်ဆေးများနှင့် ပေါင်းသတ်ဆေးများကို စိုက်ပျိုးရေးတွင်အသုံးပြုရန်အတွက် ဤသဘာဝထုတ်ကုန်များမှ ထုတ်ယူထားပါသည်။ အထူးသဖြင့် ပေါင်းပင်ထိန်းချုပ်ရေး ပေါင်းသတ်ဆေးများသည် ခေတ်မီစိုက်ပျိုးရေးတွင် သီးနှံအထွက်နှုန်းတိုးစေရန်အတွက် အရေးကြီးသောကိရိယာများဖြစ်ပြီး ဒြပ်ပေါင်းအမျိုးမျိုးကို စီးပွားဖြစ်အသုံးပြုနေကြပြီဖြစ်သည်။ အပင်များတွင် အလင်းစွမ်းအင်သုံး ဓာတ်ပြုခြင်း၊ အမိုင်နိုအက်ဆစ်ဇီဝြဖစ်ပျက်မှု၊ ဆဲလ်နံရံပေါင်းစပ်မှု၊ မိုက်တိုဆစ်ထိန်းညှိမှု၊ ဖိုင်တိုဟော်မုန်းအချက်ပြမှု သို့မဟုတ် ပရိုတင်းပေါင်းစပ်မှုကဲ့သို့သော ဆဲလ်လုပ်ငန်းစဉ်များစွာကို ပေါင်းသတ်ဆေးများ၏ ပုံမှန်ပစ်မှတ်များအဖြစ် သတ်မှတ်ကြသည်။ မိုက်ခရိုတူးဘူလ်လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားသော ဒြပ်ပေါင်းများသည် မိုက်တိုတစ်ထိန်းညှိမှုကို ထိခိုက်စေခြင်းဖြင့် အပင်ကြီးထွားမှုကို ထိခိုက်စေသော ပေါင်းသတ်ဆေးအမျိုးအစားများဖြစ်သည်။
မိုက်ခရိုတူးဘူးများသည် ဆိုက်တိုစကလက်တန်၏ အစိတ်အပိုင်းများဖြစ်ပြီး eukaryotic ဆဲလ်များတွင် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် ထိန်းသိမ်းထားသည်။ တူးဘူလင် ဟီတာရိုဒိုင်မာတွင် α-တူးဘူလင်နှင့် β-တူးဘူလင်တို့ ပါဝင်ပြီး မျဉ်းဖြောင့် မိုက်ခရိုတူးဘူး ပရိုတိုဖီလာမန့်များကို ဖွဲ့စည်းထားပြီး ပရိုတိုဖီလာမန့် ၁၃ ခုသည် ဆလင်ဒါပုံသဏ္ဍာန်ကို ဖွဲ့စည်းထားသည်။ မိုက်ခရိုတူးဘူးများသည် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်၊ ဆဲလ်ကွဲခြင်းနှင့် ဆဲလ်အတွင်းသယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကို ဆုံးဖြတ်ခြင်းအပါအဝင် အပင်ဆဲလ်များတွင် အခန်းကဏ္ဍများစွာမှ ပါဝင်သည်။ အပင်ဆဲလ်များတွင် interphase plasma membrane အောက်တွင် မိုက်ခရိုတူးဘူးများ ပါဝင်ပြီး ဤ cortical microtubules ဟုခေါ်သော ဆဲလ်လူလို့စ် ပေါင်းစပ်ဖွဲ့စည်းမှု ၄၊၅ ကို ထိန်းညှိခြင်းဖြင့် ဆယ်လူလို့စ် မိုက်ခရိုဖိုင်ဘရိုင်းများ၏ စီစဉ်မှုကို ထိန်းချုပ်သည်ဟု ယူဆရသည်။ အမြစ်အဖျား၏ လျင်မြန်စွာ ရှည်လျားသောဇုန်တွင် တည်ရှိသော root epidermal ဆဲလ်များ၏ ကော်တစ် မိုက်ခရိုတူးဘူးများသည် ဘေးတိုက်တည်ရှိပြီး ဆဲလ်လူလို့စ် မိုက်ခရိုတူးဘူးများသည် ဤမိုက်ခရိုတူးဘူးများကို လိုက်နာပြီး ဆဲလ်ကျယ်ပြန့်မှု၏ ဦးတည်ရာကို ကန့်သတ်ထားပြီး anisotropic ဆဲလ် ရှည်လျားမှုကို မြှင့်တင်ပေးသည်။ ထို့ကြောင့် မိုက်ခရိုတူးဘူး၏ လုပ်ဆောင်ချက်သည် အပင်ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် နီးကပ်စွာ ဆက်စပ်နေသည်။ tubulin ကို ကုဒ်သွင်းထားသော မျိုးဗီဇများရှိ အမိုင်နိုအက်ဆစ် အစားထိုးမှုများသည် cortical microtubule arrays များ၏ စောင်းခြင်းနှင့် Arabidopsis 6,7 တွင် ဘယ်ဘက် သို့မဟုတ် ညာဘက်ခြမ်း ကြီးထွားမှုကို ဖြစ်စေသည်။ အလားတူပင်၊ microtubule ဒိုင်းနမစ်ကို ထိန်းညှိပေးသော microtubule နှင့် ဆက်စပ်သော ပရိုတိန်းများတွင် မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုများသည် အမြစ်ကြီးထွားမှုကို ပုံပျက်စေနိုင်သည်8,9,10,11,12,13။ ထို့အပြင်၊ disopyramide သို့မဟုတ် pretilachlor ကဲ့သို့သော microtubule ကို နှောင့်ယှက်သည့် ပေါင်းသတ်ဆေးများဖြင့် ကုသခြင်းသည် ဘယ်ဘက်ခြမ်း စောင်းသော အမြစ်ကြီးထွားမှုကိုလည်း ဖြစ်စေသည်14။ ဤဒေတာများက အပင်ကြီးထွားမှု၏ ဦးတည်ရာကို ဆုံးဖြတ်ရာတွင် microtubule လုပ်ဆောင်ချက်ကို တိကျစွာ ထိန်းညှိခြင်းသည် အရေးကြီးကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
မိုက်ခရိုတူးဘူလ် အင်းဆက်ပိုးမွှားများကို ဟန့်တားပေးသည့် ဆေးအမျိုးအစား အမျိုးမျိုးကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပြီး ဤဆေးများသည် ဆဲလ်အရိုးစု သုတေသနအပြင် စိုက်ပျိုးရေးနှင့် ဆေးပညာတို့တွင်ပါ သိသာထင်ရှားသော ပံ့ပိုးကူညီမှုများ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အထူးသဖြင့် oryzalin၊ dinitroaniline ဒြပ်ပေါင်းများ၊ disopyramide၊ benzamide နှင့် ဆက်စပ်သော ဒြပ်ပေါင်းများနှင့် ၎င်းတို့၏ analog များသည် မိုက်ခရိုတူးဘူလ် လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားနိုင်ပြီး အပင်ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားနိုင်သည်။ ထို့ကြောင့် ၎င်းတို့ကို ပေါင်းသတ်ဆေးအဖြစ် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် အသုံးပြုကြသည်။ သို့သော် မိုက်ခရိုတူးဘူလ်များသည် အပင်နှင့် တိရစ္ဆာန်ဆဲလ်များ၏ အရေးကြီးသော အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုဖြစ်သောကြောင့် မိုက်ခရိုတူးဘူလ် အင်းဆက်ပိုးမွှားများကို ဟန့်တားပေးသည့် ဆေးအများစုသည် ဆဲလ်အမျိုးအစား နှစ်မျိုးလုံးအတွက် ဆိုက်တိုအဆိပ်သင့်စေသည်။ ထို့ကြောင့် ပေါင်းသတ်ဆေးအဖြစ် အသုံးဝင်ကြောင်း အသိအမှတ်ပြုထားသော်လည်း antimicrotubule အေးဂျင့် အရေအတွက် အကန့်အသတ်ဖြင့်သာ လက်တွေ့ရည်ရွယ်ချက်များအတွက် အသုံးပြုကြသည်။
Streptomyces သည် Streptomyces မျိုးရင်းဝင် မျိုးစိတ်တစ်ခုဖြစ်ပြီး ၎င်းတွင် aerobic၊ gram-positive၊ filamentous ဘက်တီးရီးယားများ ပါဝင်ပြီး ဒုတိယဇီဝဖြစ်စဉ် အမျိုးမျိုးကို ထုတ်လုပ်နိုင်စွမ်းအတွက် လူသိများသည်။ ထို့ကြောင့် ၎င်းကို ဇီဝဗေဒအရ တက်ကြွသော သဘာဝထုတ်ကုန်အသစ်များ၏ အရေးကြီးဆုံးရင်းမြစ်များထဲမှ တစ်ခုအဖြစ် သတ်မှတ်ကြသည်။ လက်ရှိလေ့လာမှုတွင်၊ Streptomyces werraensis MK493-CF1 နှင့် S. werraensis ISP 5486 မှ ခွဲထုတ်ထားသော coumamonamide ဟုခေါ်သော ဒြပ်ပေါင်းအသစ်တစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။ spectral analysis နှင့် full spectral analysis ကိုအသုံးပြု၍ coumamonamide ၏ဖွဲ့စည်းပုံကို သွင်ပြင်လက္ခဏာပြပြီး ၎င်း၏ထူးခြားသော N-alkoxypyrrole skeleton ကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ပေါင်းစပ်မှု။ ursmonoamide နှင့် ၎င်း၏ဆင်းသက်လာမှုများ၏ ဓာတုဗေဒဆိုင်ရာ အလယ်အလတ်ပစ္စည်းတစ်ခုဖြစ်သည့် Ursmonic acid သည် လူကြိုက်များသော မော်ဒယ်အပင် Arabidopsis thaliana ၏ ကြီးထွားမှုနှင့် အပင်ပေါက်မှုကို ဟန့်တားကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဖွဲ့စည်းပုံ-လှုပ်ရှားမှုဆက်နွယ်မှုလေ့လာမှုတွင်၊ ursonic acid (KAND ၏ nonyloxy derivative) ဟုခေါ်သော ursonic acid အဖြစ် ပြုပြင်ထားသော C9 ပါဝင်သော ဒြပ်ပေါင်းတစ်ခုသည် ကြီးထွားမှုနှင့် အပင်ပေါက်မှုအပေါ် တားဆီးနိုင်သော အာနိသင်ကို သိသိသာသာ မြှင့်တင်ပေးသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ထူးခြားသည်မှာ၊ မကြာသေးမီက ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သော အပင်ကြီးထွားမှုတားဆီးပစ္စည်းသည် ဆေးရွက်ကြီးနှင့် အသည်းဝါ့တ်တို့၏ ကြီးထွားမှုကိုလည်း သက်ရောက်မှုရှိပြီး ဘက်တီးရီးယား သို့မဟုတ် HeLa ဆဲလ်များအတွက် ဆိုက်တိုအဆိပ်သင့်ခြင်း မရှိပါ။ ထို့အပြင်၊ urmotonic acid ဆင်းသက်လာပစ္စည်းအချို့သည် အမြစ်ပုံပျက်နေသော phenotype ကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး ဤဆင်းသက်လာပစ္စည်းများသည် microtubules များကို တိုက်ရိုက် သို့မဟုတ် သွယ်ဝိုက်၍ သက်ရောက်မှုရှိသည်ဟု ဆိုလိုသည်။ ဤအယူအဆနှင့်အညီ၊ immunohistochemically သို့မဟုတ် fluorescent ပရိုတိန်းများဖြင့် အညွှန်းတပ်ထားသော microtubules များကို ကျွန်ုပ်တို့၏ လေ့လာတွေ့ရှိချက်များက KAND ကုသမှုသည် microtubules များကို depolymerizes လုပ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ထို့အပြင်၊ kumamotonic acid ဆင်းသက်လာပစ္စည်းဖြင့် ကုသမှုသည် actin microfilaments များကို နှောင့်ယှက်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ၎င်း၏ထူးခြားသော လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားသည် cytoskeleton ကို ဖျက်ဆီးခြင်းပါဝင်သည့် အပင်ကြီးထွားမှုတားဆီးပစ္စည်းအသစ်တစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။
MK493-CF1 မျိုးကွဲကို တိုကျို၊ ရှီနာဂါဝါ-ကူရှိ မြေဆီလွှာမှ ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ MK493-CF1 မျိုးကွဲသည် အကိုင်းအခက်ကောင်းများရှိသော stromal mycelium ကို ဖွဲ့စည်းခဲ့သည်။ 16S ribosomal RNA မျိုးဗီဇ၏ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း အစီအစဉ် (1422 bp) ကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ဤမျိုးကွဲသည် S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486၊ 1421/1422 bp၊ T: ပုံမှန်မျိုးကွဲ၊ 99.93%) နှင့် အလွန်ဆင်တူသည်။ ဤရလဒ်အပေါ်အခြေခံ၍ ဤမျိုးကွဲသည် S. werraensis အမျိုးအစားမျိုးကွဲနှင့် အနီးကပ်ဆက်စပ်နေကြောင်း ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤမျိုးကွဲကို S. werraensis MK493-CF1 ဟု ယာယီအမည်ပေးခဲ့သည်။ S. werraensis ISP 5486T သည်လည်း အလားတူ ဇီဝတက်ကြွဒြပ်ပေါင်းများကို ထုတ်လုပ်သည်။ ဤအဏုဇီဝမှ သဘာဝထုတ်ကုန်များရရှိရန်အတွက် အစောပိုင်းသုတေသန အနည်းငယ်သာရှိသောကြောင့်၊ နောက်ထပ်ဓာတုဗေဒဆိုင်ရာ သုတေသနကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ S. werraensis MK493-CF1 ကို မုယောစပါးအလယ်အလတ်တွင် ၃၀°C တွင် ၁၄ ရက်ကြာ အစိုင်အခဲအခြေအနေဖြင့် အချဉ်ဖောက်ခြင်းဖြင့် စိုက်ပျိုးပြီးနောက်၊ အလယ်အလတ်ကို EtOH ၅၀% ဖြင့် ထုတ်ယူခဲ့သည်။ နမူနာ ၆၀ ml ကို အခြောက်ခံပြီး ကုန်ကြမ်းထုတ်ယူမှု ၅၉.၅ မီလီဂရမ် ရရှိရန် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ကုန်ကြမ်းထုတ်ယူမှုကို ပြောင်းပြန်အဆင့် HPLC ဖြင့် N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1၊ coumamonamide ဟု အမည်ပေးထားပြီး ၃၆.၀ မီလီဂရမ်) ရရှိရန် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ 1 ၏ စုစုပေါင်းပမာဏသည် ကုန်ကြမ်းထုတ်ယူမှု၏ ၆၀% ခန့်ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ kumamotoamide 1 ၏ ဂုဏ်သတ္တိများကို အသေးစိတ်လေ့လာရန် ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့ကြသည်။
Coumamonamide 1 သည် အဖြူရောင် amorphous အမှုန့်ဖြစ်ပြီး high resolution mass spectrometry (HRESIMS) သည် C6H8N2O2 ကို အတည်ပြုသည် (ပုံ ၁)။ ဤဒြပ်ပေါင်း၏ C2-substituted pyrrole အပိုင်းအစသည် δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH in 1H NMR spectrum: 4.5 Hz, H-5) နှင့် δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ဖြင့် သွင်ပြင်လက္ခဏာရှိပြီး 13C NMR spectrum သည် sp2 ကာဗွန်အက်တမ်လေးခုရှိနေခြင်းကို ပြသသည်။ C2 နေရာတွင် amide အုပ်စုတစ်ခုရှိနေခြင်းကို C-3 ပရိုတွန်မှ δC 161.1 ရှိ amide carbonyl carbon အထိ HMBC ဆက်စပ်မှုဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ δH 4.10 (3H, S) နှင့် δC 68.3 တွင် 1 H နှင့် 13 C NMR ထိပ်များသည် မော်လီကျူးတွင် N-methoxy အုပ်စုများ ရှိနေခြင်းကို ညွှန်ပြသည်။ မီသိုဆီအုပ်စု၏ မှန်ကန်သောနေရာကို enhanced difference spectroscopy နှင့် nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF) ကဲ့သို့သော spectroscopic analysis ကို အသုံးပြု၍ မဆုံးဖြတ်ရသေးသော်လည်း၊ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide သည် ပထမဆုံးသော ကိုယ်စားလှယ်လောင်း ဒြပ်ပေါင်း ဖြစ်လာခဲ့သည်။
1 ၏ မှန်ကန်သောဖွဲ့စည်းပုံကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် စုစုပေါင်းပေါင်းစပ်မှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည် (ပုံ 2a)။ စီးပွားဖြစ်ရရှိနိုင်သော 2-aminopyridine 2 ကို m-CPBA ဖြင့် ကုသခြင်းသည် ပမာဏဆိုင်ရာအထွက်နှုန်းတွင် သက်ဆိုင်ရာ N-oxide 3 ကို ရရှိစေခဲ့သည်။ 2 ၏ 2-aminoazidation ပြီးနောက်၊ Abramovich မှဖော်ပြခဲ့သော cyclocondensation တုံ့ပြန်မှုကို benzene တွင် 90°C တွင် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး လိုချင်သော 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 ကို ဂရမ်ဖြင့် ရရှိရန် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ မြန်နှုန်း 60% (အဆင့်နှစ်ဆင့်)။ 15,16။ ထို့နောက် 4 ၏ မီသိုင်းလေးရှင်းနှင့် ဟိုက်ဒရိုလိုက်စစ်တို့သည် 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (“cumotonic acid”၊ 6 ဟုခေါ်သည်) ကို ကောင်းမွန်သောအထွက်နှုန်း (70%၊ အဆင့်နှစ်ဆင့်) ဖြင့် ရရှိစေခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ ရေဓာတ်ပါဝင်သော အမိုးနီးယားကိုအသုံးပြု၍ အက်ဆစ်ကလိုရိုက် အလယ်အလတ် 6 မှတစ်ဆင့် မိုက်ဒေးရှင်းပြုလုပ်ခြင်းသည် Kumamoto amide 1 ကို 98% အထွက်နှုန်းတွင် ရရှိစေခဲ့သည်။ ပေါင်းစပ်ထားသော 1 ၏ spectral data အားလုံးသည် သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော 1 နှင့်ဆင်တူသောကြောင့် 1 ၏ဖွဲ့စည်းပုံကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။
urbenamide နှင့် urbenic acid ၏ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်၏ အထွေထွေပေါင်းစပ်မှုနှင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ (က) Kumamoto amide ၏ စုစုပေါင်းပေါင်းစပ်မှု။ (ခ) ခုနစ်ရက်သားအရွယ် wild-type Arabidopsis Columbia (Col) ပျိုးပင်များကို coumamonamide 6 သို့မဟုတ် coumamonamide 1 ပါဝင်သော Murashige နှင့် Skoog (MS) ပန်းကန်များတွင် ညွှန်ပြထားသော ပြင်းအားများဖြင့် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်။ စကေးဘား = 1 စင်တီမီတာ။
ပထမဦးစွာ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် urbenamide နှင့် ၎င်း၏အလယ်အလတ်ပစ္စည်းများ၏ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာလုပ်ဆောင်ချက်များကို အပင်ကြီးထွားမှုကို ထိန်းညှိပေးနိုင်စွမ်းရှိမရှိ အကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် MS agar medium သို့ ursmonamide 1 သို့မဟုတ် ursmonic acid 6 ၏ အမျိုးမျိုးသောပါဝင်မှုများထည့်ခဲ့ပြီး ဤ medium ပေါ်တွင် Arabidopsis thaliana ပျိုးပင်များကို ပြုစုပျိုးထောင်ခဲ့ပါသည်။ ဤ assays များအရ 6 ၏ မြင့်မားသောပါဝင်မှုများ (500 μM) သည် အမြစ်ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ 2b)။ ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် N1 အနေအထား 6 ကို အစားထိုးခြင်းဖြင့် အမျိုးမျိုးသော derivatives များကို ထုတ်လုပ်ခဲ့ပြီး ၎င်းတို့အပေါ် structure-activity relationship studies များကို ပြုလုပ်ခဲ့သည် (analogue synthesis လုပ်ငန်းစဉ်ကို Supporting Information (SI) တွင်ဖော်ပြထားသည်)။ Arabidopsis ပျိုးပင်များကို 50 μM ursonic acid derivatives များပါရှိသော medium ပေါ်တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့ပြီး ရုပ်ပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း အမြစ်အရှည်ကို တိုင်းတာခဲ့သည်။ ပုံ 3a၊ b နှင့် S1 တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း coumamo acids များသည် N1 အနေအထားတွင် linear alkoxy chains (9၊ 10၊ 11၊ 12 နှင့် 13) သို့မဟုတ် large alkoxy chains (15၊ 16 နှင့် 17) ၏ အရှည်အမျိုးမျိုးရှိသည်။ ဆင်းသက်လာသော ပစ္စည်းများက အမြစ်ကြီးထွားမှုကို သိသိသာသာ ဟန့်တားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ 200 μM 10၊ 11 သို့မဟုတ် 17 ကို ထည့်သွင်းခြင်းသည် အပင်ပေါက်ခြင်းကို တားဆီးကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 3c နှင့် S2)။
Kumamoto amide နှင့် ဆက်စပ်ဒြပ်ပေါင်းများ၏ ဖွဲ့စည်းပုံ-လုပ်ဆောင်ချက်ဆက်နွယ်မှုကို လေ့လာခြင်း။ (က) analogues များ၏ ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် ပေါင်းစပ်မှုပုံစံ။ (ခ) 50 μM coumamonamide derivatives ပါ၀င်သည်ဖြစ်စေ မပါဝင်သည်ဖြစ်စေ MS medium တွင် ကြီးထွားလာသော ၇ ရက်သား အပင်ပေါက်များ၏ အမြစ်အရှည်ကို တိုင်းတာခြင်း။ ကြယ်ပွင့်များသည် sham treatment (t test, p) နှင့် သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည်။< ၀.၀၅)။ n>၁၈။ အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± SD အဖြစ် ပြသထားသည်။ nt ဆိုသည်မှာ “စမ်းသပ်မထား” ဟု ဆိုလိုသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် မျိုးစေ့ ၅၀% ကျော်သည် အပင်မပေါက်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။ (ဂ) 200 μM coumamonamide နှင့် ဆက်စပ်ဒြပ်ပေါင်းများ ပါဝင်သည်ဖြစ်စေ မပါဝင်သည်ဖြစ်စေ MS medium တွင် ၇ ရက်ကြာ ပျိုးထားရှိသော ကုသထားသော မျိုးစေ့များ၏ အပင်ပေါက်နှုန်း ပမာဏ။ ကြယ်ပွင့်လေးများသည် အတုအယောင်ကုသမှု (chi-square test) နှင့် သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည်။ n=96။
စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက C9 ထက် ပိုရှည်တဲ့ alkyl side chains တွေ ထပ်ထည့်လိုက်တဲ့အခါ inhibitory activity ကို လျော့ကျစေပြီး kumamotoic acid နဲ့ ဆက်စပ်နေတဲ့ ဒြပ်ပေါင်းတွေဟာ သူတို့ရဲ့ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ activity ကို ပြသဖို့အတွက် အရွယ်အစားတစ်ခုရှိတဲ့ side chains တွေ လိုအပ်တယ်လို့ အကြံပြုထားပါတယ်။
ဖွဲ့စည်းပုံ-လှုပ်ရှားမှုဆက်နွယ်မှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ C9 ကို ursonic acid အဖြစ် ပြုပြင်ထားပြီး ursonic acid ၏ nonyloxy derivative (ယခုအခါ KAND 11 အဖြစ်ရည်ညွှန်းသည်) သည် အပင်ကြီးထွားမှုကို အထိရောက်ဆုံး ဟန့်တားပေးသည်ဟု ပြသသောကြောင့် KAND 11 ၏ ပိုမိုအသေးစိတ်လက္ခဏာရပ်ကို ကျွန်ုပ်တို့ ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ Arabidopsis ကို 50 μM KAND 11 ဖြင့် ကုသခြင်းသည် အပင်ပေါက်ခြင်းကို လုံးဝနီးပါး ကာကွယ်ပေးသော်လည်း၊ KAND 11 ၏ နိမ့်သောပါဝင်မှုများ (40၊ 30၊ 20၊ သို့မဟုတ် 10 μM) သည် အမြစ်ကြီးထွားမှုကို ဆေးပမာဏပေါ်မူတည်၍ ဟန့်တားခဲ့သည် (ပုံ 4a၊ b)။ KAND 11 သည် အမြစ် meristem အသက်ရှင်နိုင်မှုကို သက်ရောက်မှုရှိမရှိ စမ်းသပ်ရန်အတွက်၊ propidium iodide (PI) ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော အမြစ် meristem များကို စစ်ဆေးပြီး meristem ဧရိယာအရွယ်အစားကို တိုင်းတာခဲ့သည်။ 25 μM KAND-11 ပါ၀င်သော အလယ်အလတ်တွင် ကြီးထွားလာသော ပျိုးပင်များ၏ meristem အရွယ်အစားမှာ 151.1 ± 32.5 μm ရှိပြီး DMSO ပါ၀င်သော ထိန်းချုပ်အလယ်အလတ်တွင် ကြီးထွားလာသော ပျိုးပင်များ၏ meristem အရွယ်အစားမှာ 264.7 ± 30.8 μm (ပုံ 4c၊ d) ဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းသည် KAND-11 သည် ဆဲလ်လှုပ်ရှားမှုကို ပြန်လည်ရရှိစေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ပျံ့နှံ့ခြင်း။ အမြစ် meristem။ ဤအချက်နှင့်အညီ၊ KAND 11 ကုသမှုသည် အမြစ် meristem ရှိ ဆဲလ်ကွဲထွက်မှုအမှတ်အသား CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS အချက်ပြမှုပမာဏကို လျှော့ချပေးသည် (ပုံ 4e) 17။ ဤရလဒ်များက KAND 11 သည် ဆဲလ်ပွားများခြင်းလှုပ်ရှားမှုကို လျှော့ချခြင်းဖြင့် အမြစ်ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
urbenonic acid derivatives (urbenyloxy derivatives) ၏ ကြီးထွားမှုအပေါ် အဟန့်အတားဖြစ်စေသော အာနိသင်ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။ (က) KAND 11 ၏ ညွှန်ပြထားသော ပါဝင်မှုများဖြင့် MS ပြားများပေါ်တွင် စိုက်ပျိုးထားသော ၇ ရက်သား အရွယ် wild-type Col ပျိုးပင်များ။ စကေးဘား = 1 စင်တီမီတာ။ (ခ) အမြစ်အရှည် ပမာဏ။ အက္ခရာများသည် သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည် (Tukey HSD စမ်းသပ်မှု၊ p< ၀.၀၅)။ n>၁၆။ အချက်အလက်များကို ပျမ်းမျှ ± SD အဖြစ် ပြသထားသည်။ (ဂ) 25 μM KAND 11 ပါရှိသည်ဖြစ်စေ မပါရှိသည်ဖြစ်စေ MS ပြားများပေါ်တွင် ကြီးထွားလာသော propidium iodide ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော wild-type Col အမြစ်များ၏ Confocal microscopy။ အဖြူရောင်ကွင်းစကွင်းများသည် root meristem ကို ညွှန်ပြသည်။ Scale bar = 100 µm။ (ဃ) root meristem အရွယ်အစား၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (n = 10 မှ 11)။ စာရင်းအင်းကွာခြားချက်များကို t-test (p) ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်< 0.05)။ ဘားများသည် ပျမ်းမျှ meristem အရွယ်အစားကို ကိုယ်စားပြုသည်။ (င) CDKB2 တည်ဆောက်ပုံပါရှိသော root meristem ၏ Differential interference contrast (DIC) မိုက်ခရိုစကုပ်; 1pro: CDKB2; 1-GUS ကို ဆေးဆိုးပြီး 25 µM KAND assay ပါရှိသည်ဖြစ်စေ မပါရှိသည်ဖြစ်စေ MS ပြားများပေါ်တွင် ကြီးထွားသော ၅ ရက်သား အပင်ပေါက်များတွင် ဆေးဆိုးထားသည်။
KAND 11 ၏ အပင်အဆိပ်သင့်မှုကို အခြားနှစ်မျိုးပွင့်အပင်ဖြစ်သည့် ဆေးရွက်ကြီး (Nicotiana tabacum) နှင့် အဓိကမြေယာအပင်ပုံစံသက်ရှိဖြစ်သည့် liverwort (Marchantia polymorpha) တို့ကို အသုံးပြု၍ ထပ်မံစမ်းသပ်ခဲ့သည်။ Arabidopsis ကဲ့သို့ပင် 25 μM KAND 11 ပါသည့် အလယ်အလတ်တွင် စိုက်ပျိုးထားသော ဆေးရွက်ကြီး SR-1 ပျိုးပင်များသည် အမြစ်တိုများကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည် (ပုံ 5a)။ ထို့အပြင်၊ မျိုးစေ့ ၄၈ စေ့အနက် ၄၀ စေ့သည် 200 μM KAND 11 ပါသည့် ပန်းကန်ပြားများတွင် အပင်ပေါက်ခဲ့ပြီး မျိုးစေ့ ၄၈ စေ့စလုံးသည် အတုအယောင်ပြုပြင်ထားသော အလယ်အလတ်တွင် အပင်ပေါက်ခဲ့ပြီး KAND ပါဝင်မှု မြင့်မားခြင်းသည် သိသာထင်ရှားကြောင်း ညွှန်ပြသည် (p)< 0.05; chi test -square) သည် ဆေးရွက်ကြီး၏ အပင်ပေါက်ခြင်းကို ဟန့်တားသည်။ (ပုံ 5b)။ ထို့အပြင်၊ liverwort တွင် ဘက်တီးရီးယားကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားသော KAND 11 ၏ ပါဝင်မှုသည် Arabidopsis တွင် ထိရောက်သော ပါဝင်မှုနှင့် ဆင်တူသည် (ပုံ 5c)။ ဤရလဒ်များက KAND 11 သည် အပင်အမျိုးမျိုး၏ ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် အခြားသက်ရှိများ၊ ဆိုလိုသည်မှာ လူ့ HeLa ဆဲလ်များနှင့် Escherichia coli strain DH5α တို့သည် အသီးသီး မြင့်မားသော တိရစ္ဆာန်နှင့် ဘက်တီးရီးယားဆဲလ်များကို ကိုယ်စားပြုသည့် ဝက်ဝံ monoamide နှင့် ဆက်စပ်သော ဒြပ်ပေါင်းများ၏ ဆိုက်တိုအဆိပ်သင့်မှုဖြစ်နိုင်ခြေကို စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့သည်။ ဆဲလ်ပွားများမှု စမ်းသပ်မှုများစွာတွင် coumamonamide 1၊ coumamonamidic acid 6 နှင့် KAND 11 တို့သည် 100 μM အာရုံစူးစိုက်မှုတွင် HeLa သို့မဟုတ် E. coli ဆဲလ်များ၏ ကြီးထွားမှုကို မထိခိုက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 5d၊ e)။
Arabidopsis မဟုတ်သော သက်ရှိများတွင် KAND 11 ၏ ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားခြင်း။ (က) နှစ်ပတ်သားအရွယ် တောရိုင်းအမျိုးအစား SR-1 ဆေးရွက်ကြီးပျိုးပင်များကို 25 μM KAND 11 ပါရှိသော ဒေါင်လိုက်တည်ရှိသော MS ပန်းကန်ပြားများပေါ်တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်။ (ခ) နှစ်ပတ်သားအရွယ် တောရိုင်းအမျိုးအစား SR-1 ဆေးရွက်ကြီးပျိုးပင်များကို 200 μM KAND 11 ပါရှိသော အလျားလိုက်တည်ရှိသော MS ပန်းကန်ပြားများပေါ်တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်။ (ဂ) KAND 11 ၏ ညွှန်ပြထားသော ပါဝင်မှုများဖြင့် Gambog B5 ပန်းကန်ပြားများပေါ်တွင် စိုက်ပျိုးထားသော နှစ်ပတ်သားအရွယ် တောရိုင်းအမျိုးအစား Tak-1 liverwort အဖူးများ။ အနီရောင်မြားများသည် နှစ်ပတ်ကြာ incubation ကာလအတွင်း ကြီးထွားမှုရပ်တန့်သွားသော spores ကို ညွှန်ပြသည်။ (ဃ) HeLa ဆဲလ်များ၏ ဆဲလ်ပွားများမှု စမ်းသပ်မှု။ အသက်ရှင်နိုင်သော ဆဲလ်အရေအတွက်ကို ဆဲလ်ရေတွက်ကိရိယာ 8 (Dojindo) ကို အသုံးပြု၍ အချိန်အပိုင်းအခြားများတွင် တိုင်းတာခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ်ကိရိယာအနေဖြင့် HeLa ဆဲလ်များကို 5 μg/ml actinomycin D (Act D) ဖြင့် ကုသခဲ့ပြီး RNA polymerase transcription ကို ဟန့်တားပြီး ဆဲလ်သေဆုံးမှုကို ဖြစ်စေသည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို သုံးဆခွဲ၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ (င) E. coli ဆဲလ်ပွားများမှု စမ်းသပ်မှု။ E. coli ကြီးထွားမှုကို OD600 တိုင်းတာခြင်းဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ်မှုအနေဖြင့် ဆဲလ်များကို ဘက်တီးရီးယားဆဲလ်နံရံပေါင်းစပ်မှုကို တားဆီးပေးသည့် 50 μg/ml ampicillin (Amp) ဖြင့် ကုသပေးခဲ့သည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို သုံးထပ်ခွဲ၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
uramide နှင့်ဆက်စပ်သောဒြပ်ပေါင်းများကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော cytotoxicity ၏လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားကိုဖော်ထုတ်ရန်အတွက်၊ ပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း အလယ်အလတ် inhibitory effect များဖြင့် urbenic acid derivatives များကို ပြန်လည်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည်။ ပုံ ၂ခ၊ ၆က တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ urmotonic acid ၆ မြင့်မားစွာပါဝင်မှု (၂၀၀ μM) ပါဝင်သော agar plates များပေါ်တွင်စိုက်ပျိုးထားသောပျိုးပင်များသည် ပိုတိုပြီး ဘယ်ဘက်သို့ကွေးသောအမြစ်များ (θ = – ၂၃.၇ ± ၆.၁) ကိုထုတ်လုပ်ခဲ့ပြီး၊ control medium ပေါ်တွင်စိုက်ပျိုးထားသောပျိုးပင်များတွင်၊ ပျိုးပင်များသည် ဖြောင့်တန်းသောအမြစ်များကိုထုတ်လုပ်ခဲ့သည် (θ = – ၃.၈ ± ၇.၁)။ ဤထူးခြားသော oblique growth သည် cortical microtubules များ၏ ချို့ယွင်းမှုကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသည်ဟုသိရှိကြသည်14,18။ ဤတွေ့ရှိချက်နှင့်အညီ၊ microtubule-destabilizing ဆေးများဖြစ်သော disopyramide နှင့် oryzalin တို့သည် ကျွန်ုပ်တို့၏ကြီးထွားမှုအခြေအနေများအောက်တွင် အလားတူအမြစ်စောင်းခြင်းကိုဖြစ်ပေါ်စေသည် (ပုံ ၂ခ၊ ၆က)။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် urmotonic acid derivatives များကိုစမ်းသပ်ပြီး အချို့သောပါဝင်မှုများတွင် oblique root growth ကိုဖြစ်ပေါ်စေသော ၎င်းတို့ထဲမှအများအပြားကို ရွေးချယ်ခဲ့သည်။ ဒြပ်ပေါင်း ၈၊ ၉ နှင့် ၁၅ တို့သည် 75 μM၊ 50 μM နှင့် 40 μM အသီးသီးတွင် အမြစ်ကြီးထွားမှု ဦးတည်ရာကို ပြောင်းလဲစေခဲ့ပြီး ဤဒြပ်ပေါင်းများသည် microtubules များကို ထိရောက်စွာ မတည်မငြိမ်ဖြစ်စေနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည် (ပုံ ၂ခ၊ ၆က)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် အစွမ်းထက်ဆုံး ursolic acid derivative KAND 11 ကိုလည်း ಉಪನ್ಯಾಸಿಸಿಸಿಸಿಸಿಸಿ (15 µM) တွင် စမ်းသပ်ခဲ့ပြီး KAND 11 ကို အသုံးပြုခြင်းသည် အမြစ်ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားပြီး အမြစ်ကြီးထွားမှု ဦးတည်ရာသည် ဘယ်ဘက်သို့ စောင်းသွားတတ်သော်လည်း မညီမညာဖြစ်ကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ C3)။ microtubule-destabilizing ဆေးများ၏ မြင့်မားသော ပါဝင်မှုများသည် အမြစ်စောင်းခြင်းကို ဖြစ်စေမည့်အစား အပင်ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားလေ့ရှိသောကြောင့်၊ နောက်ပိုင်းတွင် အမြစ် epidermal ဆဲလ်များရှိ cortical microtubules များကို လေ့လာခြင်းဖြင့် KAND 11 သည် microtubules များကို သက်ရောက်မှုရှိနိုင်ခြေကို ကျွန်ုပ်တို့ အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ 25 μM KAND 11 ဖြင့် ကုသထားသော ပျိုးပင်အမြစ်များ၏ အပေါ်ယံဆဲလ်များတွင် anti-β-tubulin antibodies များကို အသုံးပြု၍ Immunohistochemistry အရ elongation zone ရှိ အပေါ်ယံဆဲလ်များရှိ cortical microtubules အားလုံးနီးပါး ပျောက်ကွယ်သွားကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 6b)။ ဤရလဒ်များက kumamotonic acid နှင့် ၎င်း၏ derivatives များသည် microtubules များကို တိုက်ရိုက် သို့မဟုတ် သွယ်ဝိုက်၍ နှောင့်ယှက်ရန် လုပ်ဆောင်ကြောင်းနှင့် ဤဒြပ်ပေါင်းများသည် microtubule inhibitors အသစ်များဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
Ursonic acid နှင့် ၎င်း၏ derivatives များသည် Arabidopsis thaliana ရှိ cortical microtubules များကို ပြောင်းလဲစေသည်။ (က) ညွှန်ပြထားသော ပြင်းအားများတွင် urmotonic acid derivatives အမျိုးမျိုးရှိနေချိန်တွင် တိုင်းတာထားသော အမြစ်စောင်းထောင့်။ microtubules များကို ဟန့်တားသည်ဟု လူသိများသော ဒြပ်ပေါင်းနှစ်ခုဖြစ်သည့် disopyramide နှင့် oryzalin တို့၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုများကိုလည်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ အတွင်းပုံတွင် အမြစ်ကြီးထွားမှုထောင့်ကို တိုင်းတာရန်အသုံးပြုသော စံနှုန်းကို ပြသထားသည်။ ကြယ်ပွင့်များသည် sham treatment (t test, p) နှင့် သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည်။< ၀.၀၅)။ n>၁၉။ စကေးဘား = ၁ စင်တီမီတာ။ (ခ) elongation zone ရှိ epidermal ဆဲလ်များရှိ cortical microtubules။ 25 μM KAND 11 ပါရှိသည်ဖြစ်စေ မပါရှိသည်ဖြစ်စေ MS ပြားများပေါ်တွင် ကြီးထွားလာသော wild-type Arabidopsis Col အမြစ်များရှိ Microtubules များကို β-tubulin primary antibodies နှင့် Alexa Fluor-conjugated secondary antibodies များကို အသုံးပြု၍ immunohistochemical staining ဖြင့် မြင်ယောင်ခဲ့သည်။ စကေးဘား = 10 µm။ (ဂ) root meristem ရှိ microtubules များ၏ Mitotic ဖွဲ့စည်းပုံ။ Microtubules များကို immunohistochemical staining ဖြင့် မြင်ယောင်ခဲ့သည်။ prophase zones၊ spindles နှင့် phragmoplasts အပါအဝင် Mitotic ဖွဲ့စည်းပုံများကို confocal images များမှ ရေတွက်ခဲ့သည်။ မြှားများသည် mitotic microtubule ဖွဲ့စည်းပုံများကို ညွှန်ပြသည်။ ကြယ်ပွင့်များသည် sham ကုသမှုနှင့် သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ညွှန်ပြသည် (t test၊ p< ၀.၀၅)။ n>၉။ စကေးဘား = ၅၀ မိုက်ခရိုမီတာ။
Ursa သည် microtubule လုပ်ဆောင်ချက်ကို နှောင့်ယှက်နိုင်စွမ်းရှိသော်လည်း ၎င်း၏လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားသည် ပုံမှန် microtubule depolymerizing agents များနှင့် ကွဲပြားမည်ဟု မျှော်လင့်ရသည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ disopyramide နှင့် oryzalin ကဲ့သို့သော microtubule depolymerizing agents များ မြင့်မားစွာပါဝင်မှုသည် epidermal ဆဲလ်များ၏ anisotropic ချဲ့ထွင်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသော်လည်း KAND 11 သည် မဖြစ်ပေါ်စေပါ။ ထို့အပြင်၊ KAND 11 နှင့် disopyramide တွဲဖက်အသုံးပြုခြင်းသည် disopyramide ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော ပေါင်းစပ်အမြစ်ကြီးထွားမှုတုံ့ပြန်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး KAND 11 ကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော ကြီးထွားမှုကို ဟန့်တားခြင်းကို တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ S4)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် KAND 11 သို့ hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant ၏ တုံ့ပြန်မှုကိုလည်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ phs1-1 တွင် non-canonical tubulin kinase point mutation ရှိပြီး disopyramide9,20 ဖြင့် ကုသသောအခါ အမြစ်တိုများကို ထုတ်လုပ်သည်။ KAND 11 ပါ၀င်သော agar medium တွင် ကြီးထွားသော phs1-1 mutant ပျိုးပင်များသည် disopyramid တွင် ကြီးထွားသော အမြစ်များနှင့်ဆင်တူသော အမြစ်တိုများရှိသည် (ပုံ S5)။
ထို့အပြင်၊ KAND 11 ဖြင့် ကုသထားသော ပျိုးပင်များ၏ root meristem တွင် prophase zones၊ spindles နှင့် phragmoplasts ကဲ့သို့သော mitotic microtubule ဖွဲ့စည်းပုံများကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS အတွက် လေ့လာတွေ့ရှိချက်များနှင့်အညီ၊ mitotic microtubules အရေအတွက် သိသိသာသာ ကျဆင်းမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 6c)။
ဆဲလ်ခွဲ ကြည်လင်ပြတ်သားမှုတွင် KAND 11 ၏ ဆိုက်တိုအဆိပ်သင့်မှုကို ဖော်ပြရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆေးရွက်ကြီး BY-2 ဆိုင်းထိန်းဆဲလ်များကို KAND 11 ဖြင့် ကုသပြီး ၎င်းတို့၏ တုံ့ပြန်မှုကို လေ့လာခဲ့သည်။ cortical microtubules များအပေါ် KAND 11 ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက် TagRFP-TUA6 ကို ဖော်ပြသည့် BY-2 ဆဲလ်များထဲသို့ KAND 11 ကို ဦးစွာထည့်သွင်းခဲ့ပါသည်။ Cortical microtubules များအပေါ် KAND 11 ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို အကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။ ရုပ်ပုံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြု၍ Cortical microtubule သိပ်သည်းဆကို အကဲဖြတ်ခဲ့ပြီး cytoplasmic pixels များအကြား cytoskeletal pixels ရာခိုင်နှုန်းကို တွက်ချက်ခဲ့သည်။ assay ရလဒ်များအရ 50 μM သို့မဟုတ် 100 μM KAND 11 ဖြင့် ၁ နာရီကြာ ကုသပြီးနောက် သိပ်သည်းဆသည် 0.94 ± 0.74% သို့မဟုတ် 0.23 ± 0.28% အထိ သိသိသာသာ ကျဆင်းသွားပြီး DMSO ဖြင့် ကုသထားသော ဆဲလ်များ၏ သိပ်သည်းဆမှာ 1.61 ± 0.34% ရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ ၇က)။ ဤရလဒ်များသည် Arabidopsis တွင် KAND 11 ကုသမှုသည် cortical microtubules များ၏ depolymerization ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်ဟူသော လေ့လာတွေ့ရှိချက်နှင့် ကိုက်ညီပါသည် (ပုံ 6b)။ KAND 11 ၏ တူညီသောအာရုံစူးစိုက်မှုဖြင့် ကုသပြီးနောက် GFP-ABD-labeled actin filaments များဖြင့် BY-2 လိုင်းကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့စစ်ဆေးခဲ့ပြီး KAND 11 ကုသမှုသည် actin filaments များကို နှောင့်ယှက်ကြောင်း သတိပြုမိခဲ့သည်။ 50 μM သို့မဟုတ် 100 μM KAND 11 ဖြင့် 1 နာရီကြာ ကုသခြင်းသည် actin filament သိပ်သည်းဆကို 1.20 ± 0.62% သို့မဟုတ် 0.61 ± 0.26% အထိ သိသိသာသာ လျော့ကျစေခဲ့ပြီး DMSO-treated ဆဲလ်များတွင် သိပ်သည်းဆမှာ 1.69 ± 0.51% ဖြစ်သည် (ပုံ 2)။ 7b)။ ဤရလဒ်များသည် actin filaments များကို မထိခိုက်သော propyzamide နှင့် microtubules များကို မထိခိုက်သော actin depolymerizer တစ်ခုဖြစ်သည့် latrunculin B တို့၏ အာနိသင်များနှင့် ဆန့်ကျင်ဘက်ဖြစ်သည် (SI ပုံ S6)။ ထို့အပြင်၊ coumamonamide 1၊ coumamonamide acid 6 သို့မဟုတ် KAND 11 ဖြင့် ကုသခြင်းသည် HeLa ဆဲလ်များရှိ microtubules များကို မထိခိုက်ပါ (SI ပုံ S7)။ ထို့ကြောင့် KAND 11 ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားသည် လူသိများသော cytoskeleton disruptors များနှင့် ကွဲပြားသည်ဟု ယုံကြည်ရသည်။ ထို့အပြင်၊ KAND 11 ဖြင့် ကုသထားသော BY-2 ဆဲလ်များကို ကျွန်ုပ်တို့၏ အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းဖြင့် လေ့လာတွေ့ရှိချက်အရ KAND 11 ကုသမှုအတွင်း ဆဲလ်သေဆုံးမှု စတင်ခြင်းကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး Evans blue-stained dead cells အချိုးအစားသည် KAND 11 ကုသမှု မိနစ် ၃၀ ပြီးနောက် သိသိသာသာ မတိုးလာဘဲ၊ 50 μM သို့မဟုတ် 100 μM KAND ဖြင့် ကုသမှု မိနစ် ၉၀ ပြီးနောက်တွင် dead cells အရေအတွက်သည် အသီးသီး 43.7% သို့မဟုတ် 80.1% အထိ တိုးလာကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 7c)။ အားလုံးကို ခြုံငုံကြည့်လျှင် ဤဒေတာသည် ursolic acid derivative KAND 11 သည် ယခင်က မသိရှိရသေးသော လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားရှိသည့် အပင်-သီးသန့် cytoskeletal inhibitor တစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
KAND သည် cortical microtubules၊ actin filaments နှင့် ဆေးရွက်ကြီး BY-2 ဆဲလ်များ၏ အသက်ရှင်နိုင်မှုကို သက်ရောက်မှုရှိသည်။ (က) TagRFP-TUA6 ရှိနေချိန်တွင် BY-2 ဆဲလ်များရှိ cortical microtubules များကို မြင်ယောင်ခြင်း။ KAND 11 (50 μM သို့မဟုတ် 100 μM) သို့မဟုတ် DMSO ဖြင့် ကုသထားသော BY-2 ဆဲလ်များကို confocal microscopy ဖြင့် စစ်ဆေးခဲ့သည်။ Cortical microtubule သိပ်သည်းဆကို လွတ်လပ်သောဆဲလ် ၂၅ ခု၏ micrographs မှ တွက်ချက်ခဲ့သည်။ အက္ခရာများသည် သိသာထင်ရှားသော ကွဲပြားချက်များကို ညွှန်ပြသည် (Tukey HSD စမ်းသပ်မှု၊ p< 0.05)။ စကေးဘား = 10 µm။ (ခ) GFP-ABD2 ရှိနေချိန်တွင် မြင်ယောင်ထားသော BY-2 ဆဲလ်များရှိ Cortical actin filaments။ KAND 11 (50 μM သို့မဟုတ် 100 μM) သို့မဟုတ် DMSO ဖြင့် ကုသထားသော BY-2 ဆဲလ်များကို confocal microscopy ဖြင့် စစ်ဆေးခဲ့သည်။ cortical actin filaments ၏ သိပ်သည်းဆကို လွတ်လပ်သောဆဲလ် ၂၅ ခု၏ micrographs မှ တွက်ချက်ခဲ့သည်။ အက္ခရာများသည် သိသာထင်ရှားသော ကွဲပြားချက်များကို ညွှန်ပြသည် (Tukey HSD စမ်းသပ်မှု၊ p< 0.05)။ စကေးဘား = 10 µm။ (ဂ) Evans အပြာရောင်ဆိုးဆေးဖြင့် သေဆုံးသွားသော BY-2 ဆဲလ်များကို လေ့လာခြင်း။ KAND 11 (50 μM သို့မဟုတ် 100 μM) သို့မဟုတ် DMSO ဖြင့် ကုသထားသော BY-2 ဆဲလ်များကို တောက်ပသောလယ်ကွင်း အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းဖြင့် စစ်ဆေးခဲ့သည်။ n=3။ စကေးဘား = 100 µm။
သဘာဝထုတ်ကုန်အသစ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းနှင့် အသုံးချခြင်းသည် ဆေးပညာနှင့် စိုက်ပျိုးရေးအပါအဝင် လူ့ဘဝ၏ ကဏ္ဍအသီးသီးတွင် သိသာထင်ရှားသော တိုးတက်မှုများကို ဦးတည်စေခဲ့သည်။ သဘာဝအရင်းအမြစ်များမှ အသုံးဝင်သော ဒြပ်ပေါင်းများရရှိရန် သမိုင်းဝင်သုတေသနပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အထူးသဖြင့် actinomycetes များသည် ကင်ဆာရောဂါတိုက်ဖျက်ရေးအေးဂျင့်အဖြစ် ဆေးဝါးအဖြစ်အသုံးပြုသည့် avermectin နှင့် bleomycin နှင့် ၎င်း၏ဆင်းသက်လာသော ဒြပ်ပေါင်းများ၏ ခဲဒြပ်ပေါင်းဖြစ်သည့် avermectin နှင့် ၎င်း၏ဆင်းသက်လာသော ဒြပ်ပေါင်းကဲ့သို့သော ဒုတိယဇီဝဖြစ်စဉ်ထုတ်ကုန်အမျိုးမျိုးကို ထုတ်လုပ်နိုင်စွမ်းရှိသောကြောင့် nematodes များအတွက် ကပ်ပါးကောင်ဆန့်ကျင်ပဋိဇီဝဆေးများအဖြစ် အသုံးဝင်ကြောင်း လူသိများသည်21,22။ အလားတူပင် actinomycetes မှ ပေါင်းသတ်ဆေးဒြပ်ပေါင်းအမျိုးမျိုးကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပြီး ၎င်းတို့အနက် အချို့ကို စီးပွားဖြစ်အသုံးပြုနေပြီ1,23။ ထို့ကြောင့် လိုချင်သော ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်များဖြင့် သဘာဝထုတ်ကုန်များကို ခွဲထုတ်ရန် actinomycete ဇီဝဖြစ်စဉ်ထုတ်ကုန်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် ထိရောက်သော ဗျူဟာတစ်ခုအဖြစ် သတ်မှတ်ခံရသည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် S. werraensis မှ coumamonamide ဒြပ်ပေါင်းအသစ်တစ်ခုကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့ပြီး ၎င်းကို အောင်မြင်စွာ ပေါင်းစပ်နိုင်ခဲ့သည်။ Ursonic acid သည် urbenamide နှင့် ၎င်း၏ဆင်းသက်လာသော ဒြပ်ပေါင်းများ၏ ဓာတုဗေဒဆိုင်ရာ အလယ်အလတ်အဆင့်တစ်ခုဖြစ်သည်။ ၎င်းသည် အမြစ်များကောက်ခြင်းကို ထူးခြားစွာဖြစ်စေနိုင်ပြီး၊ အလယ်အလတ်မှ ပြင်းထန်သော ပေါင်းသတ်ဆေးလုပ်ဆောင်ချက်ကို ပြသနိုင်ပြီး အပင် microtubules များကို တိုက်ရိုက် သို့မဟုတ် သွယ်ဝိုက်၍ ပျက်စီးစေနိုင်သည်။ သို့သော်၊ urmotonic acid ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားသည် ရှိပြီးသား microtubule inhibitors များနှင့် ကွဲပြားနိုင်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် KAND 11 သည် actin filaments များကိုလည်း နှောင့်ယှက်ပြီး ဆဲလ်သေဆုံးမှုကို ဖြစ်စေသောကြောင့်ဖြစ်ပြီး၊ urmotonic acid နှင့် ၎င်း၏ဆင်းသက်လာမှုများသည် cytoskeletal ဖွဲ့စည်းပုံအမျိုးမျိုးကို လွှမ်းမိုးသည့် ထိန်းညှိယန္တရားတစ်ခုကို အကြံပြုထားသည်။
urbenonic acid ၏ နောက်ထပ်အသေးစိတ်လက္ခဏာရပ်များသည် urbenonic acid ၏လုပ်ဆောင်ချက်ယန္တရားကို ပိုမိုနားလည်ရန် ကူညီပေးပါလိမ့်မည်။ အထူးသဖြင့်၊ နောက်ရည်မှန်းချက်မှာ ursonic acid နှင့် ၎င်း၏ဆင်းသက်လာသောပစ္စည်းများသည် microtubules များအပေါ် တိုက်ရိုက်လုပ်ဆောင်ပြီး ၎င်းတို့ကို depolymerize လုပ်ခြင်းရှိမရှိ သို့မဟုတ် ၎င်းတို့၏လုပ်ဆောင်ချက်သည် microtubule မတည်ငြိမ်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေခြင်းရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ရန် လျော့နည်းသွားသော microtubules များနှင့် ချိတ်ဆက်နိုင်စွမ်းကို အကဲဖြတ်ရန်ဖြစ်သည်။ ထို့အပြင်၊ microtubules များသည် တိုက်ရိုက်ပစ်မှတ်မဟုတ်သည့်ကိစ္စတွင်၊ ursonic acid ၏ လုပ်ဆောင်သည့်နေရာနှင့် မော်လီကျူးပစ်မှတ်များကို ဖော်ထုတ်ခြင်းသည် ဆက်စပ်ဒြပ်ပေါင်းများ၏ဂုဏ်သတ္တိများနှင့် ပေါင်းသတ်ဆေးလုပ်ဆောင်ချက်ကို တိုးတက်စေရန် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသောနည်းလမ်းများကို ပိုမိုနားလည်ရန် ကူညီပေးပါလိမ့်မည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ ဇီဝလှုပ်ရှားမှုစမ်းသပ်မှုသည် Arabidopsis thaliana၊ ဆေးရွက်ကြီးနှင့် liverwort ကဲ့သို့သော အပင်များ၏ကြီးထွားမှုအပေါ် ursonic acid ၏ထူးခြားသော cytotoxic စွမ်းရည်ကို ဖော်ပြခဲ့ပြီး E. coli သို့မဟုတ် HeLa ဆဲလ်များ နှစ်မျိုးလုံး မထိခိုက်ခဲ့ပါ။ ပွင့်လင်းသော စိုက်ပျိုးရေးလယ်ကွင်းများတွင် အသုံးပြုရန်အတွက် ပေါင်းသတ်ဆေးအဖြစ် တီထွင်ပါက ursonic acid ဆင်းသက်လာသောပစ္စည်းများ၏ အားသာချက်တစ်ခုမှာ တိရစ္ဆာန်ဆဲလ်များအပေါ် အဆိပ်အတောက်အနည်းငယ်သာ သို့မဟုတ် လုံးဝမရှိပါ။ အမှန်စင်စစ်၊ microtubules များသည် eukaryotes များတွင် အဖြစ်များသောဖွဲ့စည်းပုံများဖြစ်သောကြောင့်၊ အပင်များတွင် ၎င်းတို့၏ ရွေးချယ်တားဆီးမှုသည် ပေါင်းသတ်ဆေးများအတွက် အဓိကလိုအပ်ချက်တစ်ခုဖြစ်သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ tubulin နှင့်တိုက်ရိုက်ချိတ်ဆက်ပြီး polymerization ကိုတားဆီးပေးသော microtubule depolymerizing agent ဖြစ်သော propyzamide ကို တိရစ္ဆာန်ဆဲလ်များအပေါ် အဆိပ်အတောက်နည်းပါးသောကြောင့် ပေါင်းသတ်ဆေးအဖြစ်အသုံးပြုသည်။ disopyramide နှင့်မတူဘဲ၊ ဆက်စပ် benzamides များသည် ပစ်မှတ်တိကျမှုကွဲပြားသည်။ အပင် microtubules များအပြင်၊ RH-4032 သို့မဟုတ် benzoxamide သည် တိရစ္ဆာန်ဆဲလ်များ သို့မဟုတ် oomycetes များ၏ microtubules များကိုလည်း အသီးသီးတားဆီးပေးပြီး zalilamide ကို ၎င်း၏ phytotoxicity နည်းပါးသောကြောင့် fungicide အဖြစ်အသုံးပြုသည်25,26,27။ မကြာသေးမီကရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သော ဝက်ဝံနှင့် ၎င်း၏ဆင်းသက်လာမှုများသည် အပင်များအပေါ် ရွေးချယ်ထားသော cytotoxicity ကိုပြသသော်လည်း၊ နောက်ထပ်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများသည် ၎င်းတို့၏ပစ်မှတ်တိကျမှုကိုပြောင်းလဲစေပြီး ရောဂါဖြစ်စေသော မှိုများ သို့မဟုတ် oomycetes များကိုထိန်းချုပ်ရန်အတွက် အပိုဆောင်းဆင်းသက်လာမှုများကို ပံ့ပိုးပေးနိုင်ကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။
urbenonic acid နှင့် ၎င်း၏ဆင်းသက်လာသော ပစ္စည်းများ၏ ထူးခြားသောဂုဏ်သတ္တိများသည် ပေါင်းသတ်ဆေးအဖြစ် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်စေရန်နှင့် သုတေသနကိရိယာများအဖြစ် အသုံးပြုရန် အသုံးဝင်ပါသည်။ အပင်ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန်ကို ထိန်းချုပ်ရာတွင် cytoskeleton ၏ အရေးပါမှုကို ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် အသိအမှတ်ပြုထားပါသည်။ ယခင်လေ့လာမှုများအရ အပင်များသည် morphogenesis ကို ကောင်းမွန်စွာ ထိန်းချုပ်ရန် microtubule ဒိုင်းနမစ်ကို ထိန်းချုပ်ခြင်းဖြင့် cortical microtubule အဖွဲ့အစည်း၏ ရှုပ်ထွေးသော ယန္တရားများကို တိုးတက်ပြောင်းလဲလာကြောင်း ပြသထားပါသည်။ microtubule လှုပ်ရှားမှုကို ထိန်းညှိပေးသည့် မော်လီကျူးအများအပြားကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီးဖြစ်ပြီး ဆက်စပ်သုတေသနလုပ်ငန်းများကို ဆက်လက်လုပ်ဆောင်နေဆဲဖြစ်သည်3,4,28။ အပင်ဆဲလ်များရှိ microtubule ဒိုင်းနမစ်အကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏ လက်ရှိနားလည်မှုသည် cortical microtubule အဖွဲ့အစည်း၏ ယန္တရားများကို အပြည့်အဝရှင်းပြထားခြင်းမရှိပါ။ ဥပမာအားဖြင့်၊ disopyramide နှင့် oryzalin နှစ်မျိုးလုံးသည် microtubules များကို depolymerize လုပ်နိုင်သော်လည်း disopyramide သည် အမြစ်ပုံပျက်ခြင်းကို ပြင်းထန်စွာဖြစ်စေပြီး oryzalin သည် အတော်လေးပျော့ပျောင်းသော အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိသည်။ ထို့အပြင်၊ microtubules များကို တည်ငြိမ်စေသော tubulin ရှိ မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုများသည် အမြစ်များတွင် dextrorotation ကိုလည်း ဖြစ်စေပြီး microtubule ဒိုင်းနမစ်ကိုလည်း တည်ငြိမ်စေသော paclitaxel မှာမူ မဖြစ်စေပါ။ ထို့ကြောင့် ursolic acid ၏ မော်လီကျူးပစ်မှတ်များကို လေ့လာခြင်းနှင့် ဖော်ထုတ်ခြင်းသည် အပင်၏ cortical microtubules များကို ထိန်းညှိခြင်းအတွက် အသိအမြင်အသစ်များကို ပေးစွမ်းသင့်သည်။ အလားတူပင် disopyramide ကဲ့သို့သော ပုံပျက်နေသော ကြီးထွားမှုကို မြှင့်တင်ရာတွင် ထိရောက်သော ဓာတုပစ္စည်းများနှင့် oryzalin သို့မဟုတ် kumamotoric acid ကဲ့သို့သော ထိရောက်မှုနည်းသော ဓာတုပစ္စည်းများကို အနာဂတ်တွင် နှိုင်းယှဉ်ခြင်းသည် ပုံပျက်နေသော ကြီးထွားမှု မည်သို့ဖြစ်ပေါ်သည်ကို သဲလွန်စများ ပေးစွမ်းလိမ့်မည်။
အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ ကာကွယ်ရေးနှင့်ဆက်စပ်သော cytoskeletal ပြန်လည်စီစဉ်မှုများသည် ursonic acid ၏ cytotoxicity ကိုရှင်းပြရန် နောက်ထပ်ဖြစ်နိုင်ခြေတစ်ခုဖြစ်သည်။ ရောဂါပိုးကူးစက်ခံရခြင်း သို့မဟုတ် အပင်ဆဲလ်များထဲသို့ elicitor ထည့်သွင်းခြင်းသည် cytoskeleton ပျက်စီးခြင်းနှင့် နောက်ဆက်တွဲဆဲလ်သေဆုံးမှုကို ဖြစ်စေသည်29။ ဥပမာအားဖြင့်၊ oomycete မှဆင်းသက်လာသော cryptoxanthin သည် KAND ကုသမှုနှင့်ဆင်တူသော microtubules နှင့် actin filaments များကို ဆေးရွက်ကြီးဆဲလ်သေဆုံးမှုမတိုင်မီ အနှောင့်အယှက်ပေးသည်ဟု သတင်းပို့ထားသည်30,31။ ursonic acid မှလှုံ့ဆော်သော ကာကွယ်ရေးတုံ့ပြန်မှုများနှင့် cellular responses များအကြား ဆင်တူမှုများကြောင့် cryptoxanthin ထက် ursonic acid ၏ ပိုမိုမြန်ဆန်ပြီး ပိုမိုပြင်းထန်သောအကျိုးသက်ရောက်မှုကို ထင်ရှားသော်လည်း ၎င်းတို့သည် အဖြစ်များသော cellular လုပ်ငန်းစဉ်များကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်ဟု ယူဆရန် ကျွန်ုပ်တို့အား ဦးတည်စေခဲ့သည်။ သို့သော် လေ့လာမှုများအရ actin filaments များ ပျက်ယွင်းခြင်းသည် spontaneous cell သေဆုံးခြင်းကို မြှင့်တင်ပေးပြီး microtubule ပျက်ယွင်းခြင်းနှင့်အတူ အမြဲလိုက်ပါလာခြင်းမဟုတ်ကြောင်း ပြသထားသည်29။ ထို့အပြင်၊ ရောဂါပိုး သို့မဟုတ် elicitor သည် ursonic acid derivatives များကဲ့သို့ ပုံပျက်နေသော root growth ကို ဖြစ်စေသည်ဖြစ်စေ မဖြစ်စေ စောင့်ကြည့်ရဦးမည်ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့် ကာကွယ်ရေးတုံ့ပြန်မှုများနှင့် cytoskeleton ကို ချိတ်ဆက်ပေးသော molecular knowledge သည် ဖြေရှင်းရန် ဆွဲဆောင်မှုရှိသော ပြဿနာတစ်ခုဖြစ်သည်။ ursonic acid နှင့် ဆက်စပ်သော မော်လီကျူးအလေးချိန်နည်းသော ဒြပ်ပေါင်းများအပြင် ကွဲပြားသော အာနိသင်ရှိသော derivatives အမျိုးမျိုးရှိနေခြင်းကို အသုံးချခြင်းဖြင့် ၎င်းတို့သည် မသိသော ဆဲလ်ယန္တရားများကို ပစ်မှတ်ထားရန် အခွင့်အလမ်းများ ပေးနိုင်ပါသည်။
ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင်၊ microtubule ဒိုင်းနမစ်ကို ထိန်းညှိပေးသော ဒြပ်ပေါင်းအသစ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းနှင့် အသုံးချခြင်းသည် အပင်ဆဲလ်ပုံသဏ္ဍာန် ဆုံးဖြတ်ခြင်း၏ အခြေခံရှုပ်ထွေးသော မော်လီကျူးယန္တရားများကို ဖြေရှင်းရန် အစွမ်းထက်သောနည်းလမ်းများကို ပံ့ပိုးပေးပါလိမ့်မည်။ ဤအခြေအနေတွင်၊ microtubules နှင့် actin filaments များကို သက်ရောက်မှုရှိပြီး ဆဲလ်သေဆုံးမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည့် မကြာသေးမီက တီထွင်ခဲ့သော ဒြပ်ပေါင်း urmotonic acid သည် microtubule ထိန်းချုပ်မှုနှင့် ဤအခြားယန္တရားများအကြား ဆက်စပ်မှုကို ဖော်ထုတ်ရန် အခွင့်အရေးတစ်ခု ပေးနိုင်ပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ urbenonic acid ကို အသုံးပြုသည့် ဓာတုဗေဒနှင့် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် အပင် cytoskeleton ကို ထိန်းချုပ်သော မော်လီကျူး ထိန်းညှိပေးသည့် ယန္တရားများကို နားလည်ရန် ကျွန်ုပ်တို့အား ကူညီပေးပါလိမ့်မည်။
S. werraensis MK493-CF1 ကို 2% (w/v) galactose၊ 2% (w/v) Essence paste၊ 1% (w/v) Bacto ဖွဲ့စည်းမှုတို့ပါဝင်သော မျိုးစေ့အလတ်စား 110 mL ပါဝင်သော baffled Erlenmeyer flask 500 mL ထဲသို့ ထိုးသွင်းပါ။ soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.)၊ 0.5% (w/v) ပြောင်းဖူးအနှစ် (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan)၊ 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 နှင့် 0.2% CaCO3 တို့ကို အိုင်းယွန်းကင်းစင်သောရေတွင် ရောစပ်ထားသည်။ (ပိုးသတ်ခြင်းမပြုမီ pH 7.4)။ မျိုးစေ့များကို rotary shaker (180 rpm) တွင် 27°C တွင် 2 ရက်ကြာ ထားခဲ့သည်။ solid state fermentation ဖြင့် စိုက်ပျိုးထုတ်လုပ်သည်။ မျိုးစေ့ယဉ်ကျေးမှု (၇ မီလီလီတာ) ကို ၅၀၀ မီလီလီတာ K-1 ဘူးထဲသို့ ဖိထားသော မုယောစပါး ၁၅ ဂရမ် (MUSO Co., Ltd., Japan) နှင့် အိုင်းယွန်းကင်းစင်သောရေ ၂၅ ဂရမ် (ပိုးသတ်ခြင်းမပြုမီ pH ချိန်ညှိမထားပါ) ပါဝင်သော ထုတ်လုပ်မှုအလတ်စား ၄၀ ဂရမ်ပါ၀င်သည်။ အချဉ်ဖောက်ခြင်းကို ၃၀°C တွင် မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ၁၄ ရက်ကြာ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အချဉ်ဖောက်ပစ္စည်းကို ၄၀ မီလီလီတာ/ပုလင်း EtOH ဖြင့် ထုတ်ယူပြီး centrifuge လုပ်ခဲ့သည် (၁၅၀၀ ဂရမ်၊ ၄°C၊ ၁၀ မိနစ်)။ ယဉ်ကျေးမှုအပေါ်ယံအရည် (၆၀ မီလီလီတာ) ကို ၁၀% MeOH/EtOAc ရောစပ်ထားသောအရည်ဖြင့် ထုတ်ယူခဲ့သည်။ အော်ဂဲနစ်အလွှာကို ဖိအားလျှော့ချခြင်းဖြင့် အငွေ့ပျံစေပြီး အကြွင်းအကျန် (၅၉.၅ မီလီဂရမ်) ရရှိရန် HPLC ဖြင့် gradient elution (၀–၁၀ မိနစ်: ၉၀%) ကို reverse phase column (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × အရှည် ၂၅၀ မီလီမီတာ) H2O/CH3CN၊ ၁၀–၃၅ မိနစ်: ၉၀% H2O/CH3CN မှ ၇၀% H2O/CH3CN (gradient) အထိ၊ ၃၅–၄၅ မိနစ်: ၉၀% H2O/EtOH၊ ၄၅–၁၅၅ မိနစ်: ၉၀% H2O/EtOH မှ ၁၀၀% EtOH (gradient (gradient) အထိ၊ ၁၅၅–၂၀၀ မိနစ်: ၁၀၀% EtOH) သို့ ၁.၅ ml/မိနစ် စီးဆင်းမှုနှုန်းဖြင့် coumamonamide (၁, ၃၆.၀ မီလီဂရမ်) ကို အဖြူရောင် amorphous အမှုန့်အဖြစ် ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H)။ ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ တွက်ချက်တန်ဖိုး: 141.0659၊ တိုင်းတာထားသောတန်ဖိုး: 141.0663၊ IR νmax 3451၊ 3414၊ 3173၊ 2938၊ 1603၊ 1593၊ 1537 cm–1။
Columbia မျိုးစေ့များ (Col-0) ကို သုတေသနအသုံးပြုရန် ခွင့်ပြုချက်ဖြင့် Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) မှ ရရှိခဲ့ပါသည်။ Col-0 မျိုးစေ့များကို ကျွန်ုပ်တို့၏ ဓာတ်ခွဲခန်းအခြေအနေများအောက်တွင် မျိုးပွားပြီး ထိန်းသိမ်းထားပြီး သဘာဝ Arabidopsis အပင်များအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ Arabidopsis မျိုးစေ့များကို မျက်နှာပြင်တွင် ပိုးသတ်ပြီး ၂% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical)၊ ၀.၀၅% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) နှင့် ၁.၅% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical) ပါဝင်သော half-strength Murashige နှင့် Skoog medium တွင် pH 5.7၊ ၂၃°C နှင့် အလင်းရောင်အမြဲရှိသောနေရာတွင် မွေးမြူခဲ့ပါသည်။ phs1-1 mutant ၏ မျိုးစေ့များကို T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) မှ ပံ့ပိုးပေးခဲ့ပါသည်။
SR-1 မျိုးကွဲမျိုးစေ့များကို T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) မှ ထောက်ပံ့ပေးခဲ့ပြီး သဘာဝဆေးရွက်ကြီးပင်များအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဆေးရွက်ကြီးမျိုးစေ့များကို မျက်နှာပြင်ပိုးသတ်ပြီး အပင်ပေါက်စေရန်အတွက် ပိုးသတ်ထားသောရေတွင် သုံးညစိမ်ပြီးနောက် pH 5.7 ရှိသော ၂% sucrose၊ 0.05% (w/v) MES နှင့် 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. and Skoog medium) ပါဝင်သော half-strength ပျော်ရည်တွင်ထည့်ကာ ၂၃°C တွင် အလင်းရောင်အဆက်မပြတ်အောက်တွင် ထားခဲ့သည်။
မျိုးကွဲ Tak-1 ကို T. Kohchi (ကျိုတိုတက္ကသိုလ်) မှ ပံ့ပိုးပေးခဲ့ပြီး liverwort လေ့လာမှုအတွက် စံစမ်းသပ်ယူနစ်အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ Gemma ကို ပိုးသတ်ထားသော ပျိုးပင်များမှ ရယူပြီးနောက် 1% sucrose နှင့် 0.3% gellan gum ပါဝင်သော Gamborf B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) ပေါ်တွင် ಲೇಪပြီး 23°C တွင် စဉ်ဆက်မပြတ်အလင်းရောင်အောက်တွင် ထားခဲ့သည်။
ဆေးရွက်ကြီး BY-2 ဆဲလ်များ (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ကို S. Hasezawa (တိုကျိုတက္ကသိုလ်) မှ ပံ့ပိုးပေးခဲ့သည်။ BY-2 ဆဲလ်များကို ပြုပြင်ထားသော Linsmeier နှင့် Skoog အလတ်စားတွင် ၉၅ ဆ ရောစပ်ပြီး အပတ်စဉ် 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 ဖြင့် ဖြည့်စွက်ပေးခဲ့သည်။ ဆဲလ်ဆိုင်းငံ့မှုကို မှောင်မိုက်သောနေရာတွင် ၂၇°C တွင် ၁၃၀ rpm ဖြင့် rotary shaker ပေါ်တွင် ရောစပ်ခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို ၁၀ ဆ ပမာဏရှိသော လတ်ဆတ်သောအလတ်စားဖြင့် ဆေးကြောပြီး တူညီသောအလတ်စားတွင် ပြန်လည်ရောစပ်ခဲ့သည်။ ပန်းဂေါ်ဖီစိမ်း mosaic ဗိုင်းရပ်စ် 35S ပရိုမိုတာအောက်ရှိ microtubule marker TagRFP-TUA6 သို့မဟုတ် actin filament marker GFP-ABD2 ကို တည်ငြိမ်စွာဖော်ပြသော BY-2 transgenic ဆဲလ်လိုင်းများကို ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်33,34,35။ ဤဆဲလ်လိုင်းများကို မူရင်း BY-2 ဆဲလ်လိုင်းအတွက် အသုံးပြုသည့် လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများနှင့် ဆင်တူသော လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများကို အသုံးပြု၍ ထိန်းသိမ်းပြီး ထပ်တူပြုလုပ်နိုင်သည်။
HeLa ဆဲလ်များကို ၃၇°C တွင် ၅% CO2 ရှိသော incubator တွင် ၁၀% fetal bovine serum၊ 1.2 U/ml penicillin နှင့် 1.2 μg/ml streptomycin တို့ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသော Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) တွင် မွေးမြူခဲ့သည်။
ဤလက်ရေးစာမူတွင်ဖော်ပြထားသော စမ်းသပ်မှုအားလုံးကို ဂျပန်ဇီဝဘေးကင်းရေးစည်းမျဉ်းများနှင့် လမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
ဒြပ်ပေါင်းများကို dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) တွင် စတော့ပျော်ရည်အဖြစ် ပျော်ဝင်စေပြီး Arabidopsis နှင့် ဆေးရွက်ကြီးအတွက် MS medium သို့မဟုတ် liverwort အတွက် Gambog B5 medium တွင် ရောစပ်ခဲ့သည်။ အမြစ်ကြီးထွားမှု တားဆီးစမ်းသပ်မှုအတွက် ပန်းကန်တစ်ချပ်လျှင် မျိုးစေ့ ၁၀ စေ့ထက်ပို၍ ညွှန်ပြထားသော ဒြပ်ပေါင်းများ သို့မဟုတ် DMSO ပါရှိသော agar medium တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်။ မျိုးစေ့များကို ကြီးထွားမှုအခန်းတွင် ၇ ရက်ကြာ ထားခဲ့သည်။ ပျိုးပင်များကို ဓာတ်ပုံရိုက်ကူးပြီး အမြစ်များ၏ အရှည်ကို တိုင်းတာခဲ့သည်။ Arabidopsis အပင်ပေါက်မှု စမ်းသပ်မှုအတွက် ပန်းကန်တစ်ချပ်လျှင် မျိုးစေ့ ၄၈ စေ့ကို 200 μM ဒြပ်ပေါင်း သို့မဟုတ် DMSO ပါရှိသော agar medium တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်။ Arabidopsis မျိုးစေ့များကို ကြီးထွားမှုအခန်းတွင် စိုက်ပျိုးခဲ့ပြီး အပင်ပေါက်သော ပျိုးပင်အရေအတွက်ကို အပင်ပေါက်ပြီး ၇ ရက် (dag) တွင် ရေတွက်ခဲ့သည်။ ဆေးရွက်ကြီး အပင်ပေါက်မှု စမ်းသပ်မှုအတွက် ပန်းကန်တစ်ချပ်လျှင် မျိုးစေ့ ၂၄ စေ့ကို 200 μM KAND သို့မဟုတ် DMSO ပါရှိသော agar medium တွင် စိုက်ပျိုးခဲ့သည်။ ဆေးရွက်ကြီးမျိုးစေ့များကို ကြီးထွားမှုအခန်းတွင် စိုက်ပျိုးခဲ့ပြီး အပင်ပေါက်သော ပျိုးပင်အရေအတွက်ကို ၁၄ ရက်အကြာတွင် ရေတွက်ခဲ့သည်။ liverwort ကြီးထွားမှု ဟန့်တားမှု စမ်းသပ်ချက်အတွက်၊ ပန်းကန်တစ်ခုစီမှ သန္ဓေသား ၉ ခုကို KAND သို့မဟုတ် DMSO ၏ ညွှန်ပြထားသော ပြင်းအားများပါရှိသော agar medium ပေါ်တွင် ချထားကာ ကြီးထွားခန်းထဲတွင် ၁၄ ရက်ကြာ ထားခဲ့သည်။
အမြစ်အပင်ဖွဲ့စည်းပုံကို မြင်သာစေရန်အတွက် 5 mg/ml propidium iodide (PI) ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော အပင်ပေါက်များကို အသုံးပြုပါ။ TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems) ကို အသုံးပြု၍ fluorescence microscopy ဖြင့် PI အချက်ပြမှုများကို လေ့လာခဲ့သည်။
Malami နှင့် Benfey36 မှဖော်ပြထားသော လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအတိုင်း β-glucuronidase (GUS) ဖြင့် အမြစ်များကို Histochemical staining ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ပျိုးပင်များကို 90% acetone တွင် တစ်ညလုံးစိမ်ထားပြီး GUS buffer တွင် 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid ဖြင့် 1 နာရီကြာ ဆေးဆိုးကာ hydrated chloraldehyde solution တွင်ထည့်ထားခဲ့သည်။ (8 g chloral hydrate၊ 2 ml ရေနှင့် 1 ml glycerol) နှင့် Axio Imager M1 မိုက်ခရိုစကုပ် (Carl Zeiss) ကို အသုံးပြု၍ differential interference contrast microscopy ဖြင့် စောင့်ကြည့်ခဲ့သည်။
ဒေါင်လိုက်ချထားသော ပန်းကန်ပြားများတွင် စိုက်ပျိုးထားသော ၇ ရက်သား အပင်ပေါက်များတွင် အမြစ်ထောင့်များကို တိုင်းတာခဲ့သည်။ အဆင့် ၆ တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ဆွဲငင်အား ဗက်တာ၏ ဦးတည်ရာမှ အမြစ်၏ထောင့်ကို တိုင်းတာပါ။
cortical microtubules များ၏ အစီအစဉ်ကို protocol 37 တွင် အနည်းငယ်ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း တွေ့ရှိခဲ့ရသည်။ Anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) နှင့် Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ကို primary နှင့် secondary antibodies အဖြစ် 1:1000 နှင့် 1:100 dilutions အသီးသီးဖြင့် အသုံးပြုခဲ့သည်။ Fluorescence images များကို TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems) ကို အသုံးပြု၍ ရယူခဲ့သည်။ Z-stack images များကို ရယူပြီး ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း အမြင့်ဆုံး intensity projections များကို ဖန်တီးပါ။
HeLa ဆဲလ်ပွားများမှုစမ်းသပ်မှုကို ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
E. coli DH5α ၏ ကြီးထွားမှုကို 600 nm (OD600) တွင် spectrophotometer ကို အသုံးပြု၍ ပြုစုပျိုးထောင်ရာတွင် ဆဲလ်သိပ်သည်းဆကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။
CSU-X1 confocal scanning device (Yokogawa) နှင့် sCMOS ကင်မရာ (Zyla, Andor Technology) တပ်ဆင်ထားသော fluorescence microscope ကို အသုံးပြု၍ transgenic BY-2 ဆဲလ်များရှိ Cytoskeletal ဖွဲ့စည်းပုံကို လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့ရသည်။ Cytoskeletal density ကို image analysis ဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့ပြီး၊ ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ImageJ software ကို အသုံးပြု၍ confocal images များရှိ cytoplasmic pixels များအကြား cytoskeletal pixels ရာခိုင်နှုန်းကို တွက်ချက်ခဲ့သည်။
BY-2 ဆဲလ်များတွင် ဆဲလ်သေဆုံးမှုကို ရှာဖွေရန်အတွက် ဆဲလ်ဆိုင်းပင်းရှင်း၏ အစိတ်အပိုင်းအချို့ကို အခန်းအပူချိန်တွင် 0.05% Evans blue ဖြင့် ၁၀ မိနစ်ခန့် ထားခဲ့သည်။ သေဆုံးနေသောဆဲလ်များ၏ ရွေးချယ်ထားသော Evans blue ဆိုးဆေးသည် ပလာစမာအမြှေးပါး40 မှ အသက်ရှင်နေသောဆဲလ်များမှ ဆိုးဆေးကို ထုတ်ယူခြင်းအပေါ် မူတည်သည်။ ဆိုးဆေးထားသောဆဲလ်များကို တောက်ပသောလယ်ကွင်းအဏုကြည့်မှန်ပြောင်း (BX53, Olympus) ကို အသုံးပြု၍ လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့သည်။
HeLa ဆဲလ်များကို 37°C နှင့် 5% CO2 ရှိ စိုထိုင်းဆများသော incubator တွင် 10% FBS ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသော DMEM တွင် ကြီးထွားစေခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို 37°C တွင် 6 နာရီကြာ 100 μM KAND 11၊ kumamonamic acid 6၊ kumamonamide 1၊ 100 ng/ml colcemid (Gibco) သို့မဟုတ် 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ဖြင့် ကုသခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို MetOH ဖြင့် 10 မိနစ်ကြာအောင် ပြုပြင်ပြီးနောက် အခန်းအပူချိန်တွင် 5 မိနစ်ကြာ acetate ဖြင့် ပြုပြင်ခဲ့သည်။ ပြုပြင်ထားသော ဆဲလ်များကို 0.5% BSA/PBS တွင် ရောစပ်ထားသော β-tubulin primary antibody (1D4A4၊ Proteintech: 66240-1) ဖြင့် 2 နာရီကြာ incubation လုပ်ခဲ့ပြီး TBST ဖြင့် 3 ကြိမ်ဆေးကြောပြီးနောက် Alexa Fluor goat antibody ဖြင့် incubation လုပ်ခဲ့သည်။ 488 1 နာရီ။ – Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) နှင့် 0.5% BSA/PBS တွင် ပျော်ဝင်စေထားသော 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)။ TBST ဖြင့် သုံးကြိမ်ဆေးကြောပြီးနောက်၊ Nikon Eclipse Ti-E inverted မိုက်ခရိုစကုပ်တွင် အရောင်ဆိုးထားသောဆဲလ်များကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ MetaMorph ဆော့ဖ်ဝဲ (Molecular Devices) ကို အသုံးပြု၍ အအေးခံထားသော Hamamatsu ORCA-R2 CCD ကင်မရာဖြင့် ရုပ်ပုံများကို ရိုက်ကူးခဲ့သည်။
ပို့စ်တင်ချိန်: ၂၀၂၄ ခုနှစ်၊ ဇွန်လ ၁၇ ရက်